делеция

  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителни материали и методи
  • Допълнителни таблици с легенди
  • Допълнителни легенди за изображения
  • Excel файлове
  • Допълнителна таблица 1
  • Допълнителна таблица 2
  • Файлове с изображения
  • Допълнителна фигура 1
  • Допълнителна фигура 2
  • Допълнителна фигура 3

TRAF3, протеин на цитоплазмен адаптер, наскоро беше идентифициран като кандидат за туморен супресор в редица човешки новообразувания на човешки В-клетки. Хомозиготни делеции и инактивиращи мутации в гена Traf3 са открити при неходжкинов лимфом, включително лимфом на далачната маргинална зона (MZL), хронична В-клетъчна лимфоцитна левкемия, лимфом на мантийни клетки, както и множествен миелом и макроглобулинемия на Валденстрем. 1, 2, 3, 4 Независимо дали TRAF3 делециите или мутациите играят причинно-следствена роля в В лимфомагенезата, предстои по-нататъшно проучване in vivo, използващо мишки с нокаут TRAF3.

Наскоро създадохме условен алел със загуба на Traf3 генна функция, която позволява специфичното изтриване на TRAF3 в В клетки при мишки (B-TRAF3 -/- мишки). 5 Тези мишки показват много широко разпространени популации от В-клетки във вторични лимфоидни органи поради забележително удълженото преживяване на BAFF-независими зрели В-клетки, което впоследствие беше потвърдено от Gardam et al. 6 TRAF3 и TRAF2 са сглобени, за да образуват регулаторен комплекс с cIAP1/2 и NIK, за да инхибират NF-κB сигналния път. 7, 8 Тези наблюдения определят централната роля на оста TRAF3-NIK-NF-KB2 в регулирането на преживяемостта на В-клетките. Продължителното преживяване на В-клетките е известен предразполагащ фактор за развитието на автоимунитет и В-лимфом. 9, 10 застаряващи B-TRAF3 -/- мишки развиват високи серумни нива на автоантитела към двуверижна ДНК, както и имунокомплексен гломерулонефрит. Само автоимунитетът се счита за рисков фактор за В лимфом при пациенти със системен лупус еритематозус или синдром на Sjogren. Следователно, B-TRAF3 -/- мишките могат да бъдат предразположени към В-клетъчни злокачествени заболявания. Тук съобщаваме, че мишките B-TRAF3 -/- спонтанно развиват клонални лимфоми на далака MZL или B1a до 18-месечна възраст.

Първо отбелязахме, че мишките B-TRAF3 -/- значително намаляват преживяемостта на възраст> 9 месеца (Фигура 1а). Изследвахме тъканите на 50 B-TRAF3 -/- мишки на възраст 9-18 месеца, 18, които бяха умъртвени, когато умряха и 32, които нямаха външни признаци на заболяване по време на проучването. Всички 18 умиращи мишки B-TRAF3 -/- и 20 от останалите 32 (62,5%) са имали слезен В лимфом (допълнителна таблица 1). Грубите наблюдения и микроскопските проучвания също разкриват засягане на лимфом на други тъкани, включително костен мозък, шийни и мезентериални лимфни възли, бъбреци, бели дробове и черен дроб, както и асцит (фигури 1b и c и допълнителна фигура S1 и допълнителни материали и методи). Въз основа на критериите на Bethesd класификацията на лимфоидни новообразувания 12, тумори на B-TRAF3 -/- мишки на далак са MZL, включващи както висококачествен MZL с цитология на центробластични дифузни големи B-лимфоцити, така и нискостепенен MZL с признаци на нормални MZ В клетки.

Изображение в пълен размер

Също така използвахме поточна цитометрия, за да характеризираме имунофенотипните характеристики на туморните клетки, присъстващи в далака, костния мозък и асцита (Фигура 1г и Допълнителна Фигура S2). Данните за поточната цитометрия от 21 отделни мишки са обобщени в Приложение Таблица 2. В съответствие с хистологичните диагнози, имунофенотипичните туморни профили са характерни за зрели В-клетъчни лимфоми. С едно изключение, всички анализи за канонични зрели В-клетъчни маркери - B220, CD19, IgM, IgD и IgK или Igλ - бяха положителни в различна степен. Един изключителен случай (27-9) е IgG + IgM - IgD - с 20% CD138 +. Имунофенотипичните профили на деветте изследвани лимфома наподобяват В1а клетъчния профил, докато другите два случая приличат на В1b клетъчния профил. В останалите 10 случая имаше 5 CD5 - CD11b - CD21 + CD23 - които приличаха на нормални MZ B клетки. Повече от половината (11/21) от TRAF3 -/- В лимфомите идват от В1 В клетки и други 23% (5/21) идват от MZ В клетки. Това предполага, че много случаи, диагностицирани хистологично като центробластични дифузни големи В-клетъчни лимфоми, всъщност са висококачествени MZL на далака.

След това извършихме Southern blot анализ на IgH гена на първични туморни проби от 21 отделни мишки B-TRAF3 -/-, за да определим тяхната клоналност. Резултатите (Фигура 1д) разкриват наличието на една или повече не-зародишни ивици във всяка от тестваните ДНК, което показва моноклонални или олигоклонални експанзии на злокачествени В клетки. ДНК, приготвена от две или три тъкани на една и съща мишка, често показва пренаредени ленти с подобен размер, което показва метастатично разпространение на един и същ клон.

Тези наблюдения ни накараха да потърсим по-преки доказателства за злокачествена трансформация чрез интраперитонеално прехвърляне на туморни клетки с известни клонални популации на имунодефицитни NOD SCID мишки. 2 до 3 месеца след предаването е установено, че реципиентните мишки имат лимфомни инфилтрати в множество тъкани. Трансплантираните тумори имат същите имунофенотипични характеристики като донорската популация (Фигура 1е). Анализът на Southern blot разкрива, че една или две клонални популации от първични TRAF3 -/- B лимфоми се размножават в NOD SCID реципиентни мишки (Фигура 1g). По този начин спонтанните В лимфоми, които се развиват в мишките B-TRAF3 -/- са клонални, злокачествени и трансплантируеми.

За да получим допълнителна информация за произхода, разпространението и историята на злокачествените В клетки, клонирахме и секвенирахме IgH V (D) J области на лимфоми от 11 мишки B-TRAF3 -/- (Таблица 1). IgH последователности В областта на 10 от 11-те изследвани мишки те не показват значителна соматична хипермутация, което предполага, че те не са получени от зародишни клетки, пасажирани в центъра, а по-скоро от наивни прегерминални средни В клетки, MZ В клетки или В1 клетки . Интересното е, че всички основни VH последователности, идентифицирани в TRAF3 -/- B лимфоми, принадлежат към едно от четирите семейства VH, VH1 (J558), VH3 (VH36-60), VH5 (VH7183) и VH12. Тези семейства гени често използват MZ, B1 или автореактивни В клетки. Следователно, IgH V (D) J последователностите, заедно с хистопатологичните и имунофенотипните данни, позволяват класифицирането на В лимфомите, развити при повечето мишки B-TRAF3 -/- като MZL или B1 лимфоми на далака.

Маса в пълен размер

Преди това демонстрирахме конститутивна активация на NF-κB2 и намалена PKC5 ядрена транслокация, но нормална CD40-индуцирана NF-κB1 активация в TRAF3 -/- B премалигнени клетки.5 Тук ние разширихме нашите анализи на тези пътища до B-TRAF3 -/- миши лимфоми. Установихме, че повишените ядрени нива на субединиците NF-kB2, p52 и RelB и намалените ядрени нива на PKC5 също са показателни за първичните В лимфоми (Фигура 2а). Интересното е, че TRAF3 -/- B лимфомите също леко повишават ядрените нива на NF-κB1. По този начин сигнализиращият пейзаж на TRAF3 -/- B лимфомите се характеризира с конститутивно активиране на NF-kB2 и NF-KB1 (макар и в по-малка степен) пътища, както и намалена PKC5 ядрена транслокация.

Изображение в пълен размер

За да проверим дали анормалните пътища за активиране на NF-кВ могат да служат като терапевтични цели за В-клетъчни новообразувания, свързани с инактивиране на TRAF3, оценихме ефектите на лекарствата, които модулират активирането на NF-кВ с помощта на пречистени от B-TRAF3 първични B-лимфомни клетки върху клетъчната жизнеспособност . -/- мишки. Използвахме инхибитора IKK2, BMS-345541, 13 и NF-κB инхибитора, оридонин. 14 Ефектите на тези вещества са сравнени с тези на лекарства, използвани клинично за лечение на В лимфоми или левкемии - винкристин, всички транс-ретиноева киселина, доксорубицин и циклофосфамид. Установихме, че оридонинът показва силна дозозависима туморицидна активност върху първичните лимфомни клетки, докато BMS-345541 и четири клинични лекарства са неактивни (фигури 2b и c и допълнителна фигура S3).

За да разберем механизмите на оридонин, определихме нивата на субединиците NF-κB и NF-κB1 в цитозолни и ядрени екстракти на първични В лимфоми. Нивата на активирани NF-κB2 и NF-κB1 в ядрото са значително намалени в третираните с оридонин клетки В лимфом (Фигура 2г). Освен това оридонинът не повлиява PKC5 ядрената транслокация или ERK, p38, JNK и активацията на AKT (Фигура 2г и данните не са показани). По този начин мощните туморицидни ефекти на оридонин могат да се отдадат на неговата активност при инхибиране на активирането на NF-κB2 и NF-κB1, което предполага, че оридонинът или тясно свързаното вещество трябва да се разглеждат като нови кандидати за лечение на характеризирани В-клетъчни новообразувания . генетично/епигенетично инактивиране на TRAF3.

По-нататък се опитахме специално да намалим нивото на NF-κB2, използвайки лентивирусни shRNA вектори, за да оценим ролята на конститутивното активиране на NF-kB в лимфомагенезата на TRAF3 -/- B. Тествахме 4 лентивирусни shRNA вектори NF-κB2 shRNA. NF-κB shRNA 653 и 1226 потискат p100 и p52 NF-κB2 протеини съответно с -95% и 75%. Впоследствие използвахме тези shRNA лентивируси, за да трансдуцираме 27-9.5.3 TRAF3 -/- B-лимфомната клетъчна линия, генерирана в това проучване (допълнителни материали и методи). Интересното е, че NF-kB2 shRNA 653 и 1226 инхибират пролиферацията и индуцират апоптоза в клетките 27-9.5.3. Важно е, че ефикасността на двете shRNAs при съсирване на NF-κB2 протеини корелира с тяхната способност да инхибират пролиферацията и да индуцират апоптоза в TRAF3 -/- B-лимфомни клетки (Фигура 3). Въпреки че се изисква потвърждение от други линии на TRAF3 -/- B-лимфом, нашите данни показват, че конститутивното активиране на NF-κB2 е един от основните онкогенни пътища в TRAF3 -/- В клетките.

NF-κB shRNAs индуцират апоптоза в TRAF3 -/- B-лимфомни клетки. В-лимфомни клетки на мишка (клетъчна линия M12.4.1 in ( а ) и TRAF3 -/- В лимфом клетъчна линия 27-9, 5, 3 in ( б, ° С, д )) бяха трансдуцирани с лентивируси, експресиращи миши NF-κB shRNA или разбъркани shRNA (SCR). а ) Общи нива на p100 и p52 NF-κB2 клетъчни протеини, определени чрез имуноблот анализ. Протеини бяха получени от клетки на В-лимфом, трансдуцирани с разбъркани shRNA или NF-KBB shRNA 653, 1226, 2716 или 2996. Актинов имуноблот беше използван като контрола на натоварването. ( б ) Криви на растеж на живите клетки и ( ° С ) процент на живи спрямо мъртви клетки, определен чрез преброяване на синьо оцветени клетки с трипан. Графиките показват резултати от три независими експеримента (средно ± sd). д ) Представителни FACS профили на трансдуцирани клетки, анализирани чрез оцветяване с анексин V и пропидиев йодид (PI). Апоптотичните клетки бяха идентифицирани като анексин V + PI-, мъртвите клетки бяха анексин V + PI +, а живите клетки бяха анексин V-PI−. Данните представляват три независими експеримента.

Изображение в пълен размер

Изследвания, които идентифицират TRAF3 делеции и мутации в В-клетъчна хронична лимфоцитна левкемия, MZL, мантийно-клетъчен лимфом, макроглобулинемия на Waldenström и множествен миелом предполагат потенциална туморно-супресивна функция на TRAF3. 1, 2, 3, 4 Парадоксално е, че трансгенните мишки, свръхекспресиращи TRAF3 във В клетки, показват автоимунно заболяване, системно възпаление и са склонни към рак. 15 Един вариант, представен от Zapata et al. 15 е, че TRAF3 може да стимулира диференциацията на плазмените клетки. Алтернативно, неочакваният фенотип на TRAF3-трансгенни мишки може потенциално да се свърже с място за вмъкване на трансген в генома, което може да повлияе на експресията или функцията на други важни гени, като се има предвид, че само една трансгенна основа основа е била изследвана в детайли. 15 Тук спонтанното, силно проникващо развитие на В-лимфомите в мишките B-TRAF3 -/- предоставя убедителни доказателства, че Traf3 е туморен супресорен ген във В клетки.

Обединените данни, представени в това проучване, предполагат, че мишките B-TRAF3 -/- моделират отблизо човешкия далак MZL и В-клетъчната хронична лимфоцитна левкемия. Използвайки клетки на В-лимфом, получени от мишки B-TRAF3 -/- като моделни системи, ние показахме, че оридонинът и NF-KBB2 shRNAs имат терапевтичен потенциал. Нашите открития показват, че възстановяването на протеин TRAF3 или неговите сигнални пътища надолу по веригата е важен терапевтичен път за В лимфоми. В това отношение мишките B-TRAF3 -/- предоставят полезен инструмент за разработването и тестването на терапевтични лекарства за лечение на човешки B-клетъчни новообразувания, които включват инактивиране на TRAF3 или свързани генетични/епигенетични промени.