Пречистването на свръхекспресирания протеин формира втория и не по-малко важен етап от производството на чистия рекомбинантен протеин в хетероложна експресионна система. Рядко получаваме рекомбинантен протеин директно от течна, извънклетъчна среда (хранителна среда), въпреки че някои експресионни системи позволяват такава протеинова секреция. Първата стъпка в пречистването на която и да е молекула от биологичен материал е разрушаването на клетъчната стена и цитоплазматичната мембрана, като по този начин я освобождава в разтвор.
Ние знаем няколко начина за разрушаване на клетките:
- повтаря се замразяване и размразяване материал - разрушаването е причинено от образуването на ледени кристали (може да денатурира някои протеини)
- механични - хомогенизиране в хоросан или по-сложен апарат
- химически - различни силни детергенти, разтворители (те могат да денатурират някои протеини; трябва да се използват за разтваряне на мембранни протеини - напр. Triton X-100, CHAPS)
- ензимен - действие на ензимите върху клетъчните стени (напр. целулази, пектинази, лизозим за бактерии, зимолаза за дрожди)
В случай на протеини, „агресивният“ метод (или комбинация от методи) зависи от тяхното местоположение (напр. Клетъчно ядро, цитоплазма, мембранен протеин, периплазматична локализация в случай на грам-отрицателни бактерии), както и от произхода и природата на клетките (наличие на клетъчна стена).) трябва да се използва за:
- освободи достатъчно количество протеин в разтвор, т.е. разтворима фаза
- запазват формата (конформацията) и биологичната активност на протеина
Връзка за хомогенизация
Хомогенизацията е един от механичните методи за разрушаване на клетките. След хомогенизиране протеините се въвеждат в разтвор, който трябва да има определен подходящ състав и рН, за да не загуби биологичните си свойства. Ние му се обаждаме буфер (буфер), тъй като "намалява" колебанията на pH, причинени от различните присъстващи химични съединения.
| буфер | рН диапазон |
| фосфат (NaH2PO4 + Na2HPO4) | 5,8 - 8,0 |
| Tris-HCl | 7,0 - 9,0 |
| цитрат (натриев ацетат + лимонена киселина) | 3,0 - 6,2 |
Най-използваните хомогенизатори са:
- Потър хомогенизатор - най-разпространеният материал са клетъчни култури от животински произход, които се хомогенизират чрез триене на буталото върху стъклен хоросан във формата на цилиндър
- ултразвуков хомогенизатор, т.нар. соникатор - използва ултразвукови вълни за разрушаване на клетките
- Френска преса - високо налягане (6000-10000 psi) се прилага към клетъчната суспензия с помощта на хидравлична помпа, след което окачването внезапно се изпразва през тесен капиляр, клетките се пукат поради декомпресия и срязваща сила, напускаща камерата; Френската преса се използва главно за извличане на протеини от бактериални клетки
- хомогенизатори, използващи магнитна сила, трансформирана в кинетичната енергия на зърната за разрушаване на клетките, която нарушава клетъчните повърхности чрез триене и разклащане на суспензията; те често се използват за извличане на протеини от животински органи и тъкани
Хомогенизацията води до суспензия - хомогенат.
Връзка към буферни добавки
Използването на различни химикали като добавки в буферния разтвор не винаги е необходимо. Това са вещества, които спомагат за разтваряне или стабилизиране на определени протеини. Подходящо подбраните добавки не трябва да засягат други процедури за пречистване, или трябва да се отстранява от разтвора чрез диализа или гел филтрация.
| група | пример | крайна концентрация | цел на употреба |
| сол | NaCl, KCl, (NH4) 2S04 | 50-150 mM | поддържане на йонна сила на разтвора, взаимодействие на протеини с носителя, утаяване на протеини |
| перилни препарати | Triton X-100, NP-40, CHAPS | 0,1-1% | солюбилизация на мембранните протеини |
| глицерол | - | 5-10% | стабилизиране и предотвратяване на белтъчната агрегация |
| въглехидрати | глюкоза, захароза | 25 mM | стабилизирането на лизозомните мембрани е превенция на секрецията на протеаза |
| двувалентни катионни хелатори ("чистачи") | EDTA, EGTA | 1 mM | намаляване на окислителното увреждане, инхибиране на някои протеази |
| редуциращи агенти | DTT | 1-10 mM | намаляване на окислителното увреждане, при по-висока концентрация намаляване на S-S връзките |
| β-меркаптоетанол | 0,05% | ||
| лиганди, метални йони | Mg 2+, ATP, GTP | 1-10 mM | стабилизиране на някои протеини |
Връзка за ултрацентрифугиране
Хомогенатът съдържа различни големи и тежки частици (клетъчни отломки, т.е. клетъчни остатъци, органели, мембрани) и разтворим материал (фиг., А1, В2). Използвайки няколко цикъла на центрофугиране при различни скорости и времена, можем до известна степен да отделим определени фракции с желаните протеини (фиг., А). Центрофугирането при много ниски скорости (500 g/10 минути) дава възможност да се изолират най-тежките клетъчни ядра (фиг., А2), така че да е подходящо за извличане на ядрени протеини. Ако приемем, че нашият рекомбинантен протеин е разтворим, ние центрофугираме при по-високи скорости (10 000 g/20 min), за да отстраним повечето ненужни, замърсяващи материали. За разлика от това, изолирането на мембранни частици с мембранни протеини изисква ултрацентрифугиране (100 000 g/60 минути) (фиг., A3). Центрофугирането разделя суспензията на неразтворима утайка (пелети) (в долната част на тръбата) и супернатант (решение).
Понякога обаче може да бъде полезно диференциално центрофугиране с градиент на плътността (напр. захароза) (фиг., В1), особено ако искаме да отделим клетъчните органели или по-леките тела за включване, образувани от рекомбинантни протеинови агрегати, от клетъчните остатъци. В този случай най-тежките отломки се утаяват на дъното на тръбата, но по-леките частици не могат да паднат под нивото на по-концентрирания разтвор на захароза. Резултатът е гранула, разделена на отделни фракции (фиг., В3), в зависимост от плътността на захарозата. Разтворимият материал винаги ще бъде в най-горната фракция, защото е най-лекият.
Връзка за валежи с протеин
Освен това, протеините често се нуждаят от селективно утаяване - утайка от хетерогенно решение. Най-използваният химикал е амониев сулфат - (NH4) 2SO4, което причинява т.нар постепенно осоляващ ефект протеини в зависимост от тяхната разтворимост в разтвор с различна йонна сила. Принципът е основно "конкуренцията" на амониевия сулфат с протеина за молекули разтворител (вода). Утаеният протеин образува агрегати (чрез хидрофобни взаимодействия), така че да се отдели от разтворимата фаза центрофугиране. По този начин е възможно, с увеличаване на концентрацията на амониев сулфат, да се съберат няколко фракции, съдържащи различни протеини, и да се анализират тези фракции за наличието на въпросния рекомбинантен протеин (например чрез SDS-PAGE).
Утаяването на протеини по този начин не води до денатурация на протеините. Амониевият сулфат може да бъде отстранен от разтвора чрез диализа. Това е бърз и евтин метод за първоначално отстраняване на повечето замърсяващи протеини.
Диализна връзка
Диализата на протеинов разтвор е метод за премахване на химикали с ниско молекулно тегло от разтвора, които могат да повлияят неблагоприятно на по-нататъшните етапи на пречистване, или биологични свойства на протеина. Диализата се извършва в диализни торбички с постоянно разбъркване в буфер и при ниска температура (4 ° C). Порите на диализната торба позволяват преминаването само на малки молекули, докато се постигне равновесие между съставите на двата разтвора. Протеинът остава затворен в диализната торба.
Чрез диализа някои протеини могат да бъдат ренатурирани до биологично активна конформация. За да бъде ренатурацията възможно най-ефективна, тя трябва да се извършва много бавно, често в много разреден разтвор и по този начин в голям обем.