абстрактно
ЦЕЛТА: В настоящото изследване разгледахме въпроса дали има депо-специфична експресия на клетъчния инхибитор на апоптоза протеин-2 (cIAP2) в детска възраст и дали относителната експресия се променя с възрастта успоредно с нарастващия риск от висцерално затлъстяване.
Теми: Сдвоени проби от човешка мастна (OM) и подкожна (SC) мастна тъкан са получени от 23 пациенти (12 деца и 11 възрастни).
МЕТОД: Нивото на MRNA на cIAP2 се определя, като се използва полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR) и протеинова експресия, потвърдена от Western blot. Индексите на апоптоза се определят чрез крайно деоксинуклеотидил трансфераза-медиирано маркиране на dUTP-флуоресцеин никел-край (TUNEL).
РЕЗУЛТАТИТЕ: mRNA на cIAP2 е 1,5 пъти по-висока в OM в сравнение с SC мастната тъкан (OM> SC при 20 от 23 субекта; P SC при девет от 10 субекта, P 1
Затлъстяването се характеризира с увеличаване на теглото на мастната тъкан. Теглото на телесните мазнини, особено натрупването на висцерални мазнини, е тясно свързано с инсулинова резистентност, сърдечно-съдови заболявания, хипертония и други основни метаболитни нарушения. 2 Това подчертава важността на идентифицирането на генетични фактори, регулиращи не само мазнините, но и разпределението на мазнините.
Известно е, че одитовите (OM) и подкожните (SC) адипоцити се различават по различни метаболитни свойства, регулиращи обема на мастните клетки. Репликацията, диференциацията и апоптотичният отговор на човешките мастни клетки изглежда се влияят от анатомичния регион. 5, 6. Следователно разпределението на мастната тъкан може да бъде резултат от специфична за мястото разлика в регулирането на тези процеси. Наскоро беше показано, че регионалните характеристики могат да бъдат свързани със специфичните за мястото разлики в експресията на гени, кодиращи важни функционални протеини. Например, експресията на лептин и PPAR γ е по-висока в SC от мастната тъкан OM. За разлика от тях, експресията на инсулиновия рецептор (Ex 11 -) е по-висока в OM в сравнение с SC мастната тъкан. 9
Клетъчният инхибитор на протеинова апоптоза-2 (cIAP2) е член на семейството на инхибиторите на апоптозни протеини (IAPs), който участва в регулирането на апоптозата по време на клетъчната пролиферация и диференциация. Ролята на IAP в човешката мастна тъкан е неясна, но нарастващият брой доказателства предполага, че тя може да играе роля в регулирането на разпределението на телесните мазнини чрез модулиране на апоптозата на мастните клетки. Един доклад показва, че зависимата от диференциацията експресия на инхибиторния протеин на невроналната апоптоза (NAIP) в 3T3-L1 мастните клетки може да корелира с развитието на резистентност към адипоцити към апоптоза. Две други проучвания съобщават, че cIAP2 иРНК се експресира по специфичен за депо начин при възрастни човешки адипоцити. 14, 15
Досега изследванията върху разликата в генната експресия са фокусирани върху възрастни. Много малко се знае за генната експресия на мястото на поява в мастната тъкан при деца. Тъй като съществуват зависими от възрастта разлики в човешката мастна тъкан по отношение на теглото и разпределението, ние разгледахме въпроса дали има депо-специфична експресия на cIAP2 в детска възраст и ако е така, ако относителната експресия се променя с възрастта успоредно с увеличаването доза. риск от висцерално затлъстяване. Поради това в това проучване сравнихме нивата на експресия на cIAP2 както на нивата на иРНК, така и на протеините в OM и SC мастната тъкан при деца и възрастни. Освен това изследвахме връзката между нивата на експресия на cIAP2 и скоростта на апоптоза на адипоцитите, индекса на телесна маса (ИТМ) и пола.
методи
Субекти и вземане на проби
Приготвяне на РНК и RT-PCR
Нивата на иРНК на CIAP2 са определени при всички субекти, от които е била налична обща РНК както от SC, така и от OM мастната тъкан. Общата РНК се приготвя, като се използва TRIzol Reagent (Invitrogen life technologies, CA, USA) съгласно протокола на производителя. РНК се определя количествено спектрофотометрично. Целостта на РНК се проверява чрез оцветяване на рибозомни РНК ленти с етидиев бромид, като се използва 1% агарозен гел. Получената РНК се съхранява при -70 ° С до употреба.
RT-PCR се извършва за анализ на cIAP2 иРНК. Общата РНК (0,5 ∼ 1 μg) се транскрибира обратно за 1 h при 42 ° C в 20 μl буфер, съдържащ 200 U MMLV обратна транскриптаза, 0,5 μg Oligo d (T) 16, 0,5 mmol/l dNTP Допълнителни ДНК (cDNA) проби се денатурират в продължение на 5 минути при 95 ° С и 5 μl cDNA от всяка проба се използва за последваща PCR амплификация в краен обем от 50 μl буфер, съдържащ 2,5 U Taq ДНК полимераза.2 mmol/l. dNTPs, 2,5 mmol/l MgCl2 и 0,4 μmol/l всеки грунд. PCR условията бяха 95 ° С за 5 минути, последвани от 30 цикъла от 94 ° С за 30 s, 60 ° C за 45 s и 72 ° C за 1 минута и накрая 72 ° C удължаване за още 10 минути. RT реагентите са доставени от Promega Corp. (Медисън, САЩ). PCR реагентите са от Roche (Манхайм, Германия). Два комплекта праймери бяха използвани едновременно в тази полуколичествена RT-PCR (Таблица 1). Използван е различен брой PCR цикли, за да се гарантира, че както усилването на cIAP2, така и β-актин cDNA е в експоненциалния диапазон. Праймери за β-актин бяха добавени в шестия кръг на всяко PCR усилване.
Маса в пълен размер
След амплификация, 10 μl от сместа се разделят върху 1,5% агарозен гел, оцветен с етидиев бромид. Геловете се визуализират под ултравиолетова светлина, плътността, както и съотношението на cIAP2 към β-актина се измерва и анализира с помощта на софтуера Quantitation, версия 4 Windows и Macintosh (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
Протеинова изолация и Western blot анализ
Откриване на апоптоза
Апоптотични адипоцити в 15 сдвоени проби бяха открити чрез терминално деоксинуклеотидил трансфераза-медиирано маркиране на dUTP-флуоресцеин никел-край (TUNEL) съгласно протокола на производителя. Апоптотичните индекси са получени чрез преброяване на 200 адипоцити в поне четири зрителни полета под светлинен микроскоп.
Статистически анализ
Данните бяха анализирани с помощта на Статистическия пакет за социални науки (SPSS) и им беше присвоена стойност P по-малка от 0,05. Тъй като експресията на cIAP2 в мастната тъкан обикновено не беше разпределена, те са представени като медиана (интерквартилен диапазон) в текста и таблицата. За сравняване на експресионните разлики между SC и OM е използван подписан ранг тест на Wilcoxon; Тестът на Ман-Уитни е използван за сравняване на специфичните за депо разлики между деца и възрастни. Корелациите са изчислени чрез тест на коефициента на корелация на Спиърман.
резултатът
Сравненията по двойки на cIAP2 иРНК експресия от SC и OM мастна тъкан бяха количествено определени чрез RT-PCR, както е показано на Фигура 1а. Имаше забележими вариации в нивото на експресия между индивидите, особено в OM (Фигура 1b). Независимо от това, имаше значителна депо-специфична разлика в нивото на експресия на cIAP2 mRNA (Таблица 2). иРНК на cIAP2 е 1,5 пъти по-висока в OM в сравнение с SC мастна тъкан (OM> SC при 20 от 23 субекта; P 
Специфични за депо разлики в експресията на cIAP2 иРНК. а) Пример за анализ на агарозен гел след RT-PCR на сдвоени проби от мастна тъкан SC и OM от пет индивида. (б) Скатерните графики показват, че експресията на cIAP2 иРНК в SC и OM е мастна на всички индивиди. Хоризонталните ленти показват средната стойност.
Изображение в пълен размер
Маса в пълен размер
Western blots са показани на Фигура 2. В съответствие с експресията на mRNA, нивата на cIAP2 протеин са по-високи в OM в сравнение с SC (OM> SC при девет от 10 субекта, P
Депо-специфични разлики в експресията на протеин cIAP2. (а) Пример за имуноблоти на cIAP2 протеини от SC и OM мастна тъкан от четири индивида. (b) Скатерните графики показват експресия на протеин cIAP2 в SC и OM мазнини на 10 индивида. Хоризонталните ленти показват средната стойност.
Изображение в пълен размер
Имунохистохимичният анализ не показва разлика между SC и OM в апоптотичните индекси на адипоцитите (апоптотични индекси 14, които демонстрират по-висока експресия на cIAP2 иРНК в ОМ, отколкото при възрастни SC адипоцити. Изследването им се фокусира само върху нивата на иРНК, тъй като експресията на иРНК не винаги отразявайки експресията на протеин или концентрацията на напълно обработен протеин, ние разширихме наблюдението, като потвърдихме, че основната разлика между ОМ и SC мастната тъкан също се среща на ниво протеин.
CIAP2 първоначално е идентифициран като протеин, който се свързва с TNF-рецепторния сигнален комплекс, което предполага, че може да участва в регулирането на TNFα сигнализирането. Свръхекспресията на човешкия протеин cIAP2 може да потисне клетъчната смърт, предизвикана от различни стимули. В сравнение с изолирани от човека адипоцити, преадипоцитите, култивирани в серум-съдържаща среда, имат по-високи нива на cIAP2 иРНК, както и по-ниска чувствителност към TNFα-индуцирана апоптоза. 14, 15, 17 Следователно, експресията на cIAP2 в SC и OM мастната тъкан може да отразява специфичната за депо чувствителност към апоптоза и по този начин загуба или отлагане на мастна тъкан.
Растежът и разпространението на човешката мастна тъкан силно зависи от възрастта и пола. Натрупването на специфични за мястото мастни клетки в ранна възраст може да допринесе за отлагането на депо-специфични мастни запаси в по-късна възраст. Много наблюдения показват, че затлъстяването се програмира по време на критични периоди на развитие, например затлъстяването в ранна детска възраст следва зле в зряла възраст, докато затлъстяването в юношеска възраст увеличава риска от персистиращо затлъстяване и неговите усложнения. В това проучване сравнихме модела на експресия на cIAP2 при деца с възрастни. Резултатите показаха, че специфичната за депо разлика в експресията на cIAP2 иРНК е постоянна при деца и възрастни. Експресията на иРНК на CIAP2 не показва значими възрастово зависими промени. Също така няма значими връзки между експресията на cIAP2 иРНК и ИТМ или пола. Интересното е, че разликата между OM и SC е по-изразена при децата. Тъй като висцералната мастна тъкан е ограничена в детска възраст, като цяло, по-високата експресия при децата може да отразява само нетната печалба във висцералната мастна тъкан по време на растеж и по този начин по-ниска податливост на апоптоза. Тази възможност се подкрепя от наблюдението, че нивата на експресия на NIAP в подкожните коремни преадипоцити са 3-5 пъти по-високи след загуба на тегло, което насърчава възстановяването на теглото. 20.
В това проучване не успяхме да демонстрираме каквато и да е разлика в базалната скорост на апоптоза между адипоцитите от двете депа. Вероятното обяснение е, че базалните апоптотични индекси са били твърде ниски за точно определяне и сравнение. Това мнение се подкрепя от факта, че Prins et al. 17 показва, че базалният апоптотичен индекс на мастните клетки, култивирани в серум-съдържаща среда, е много нисък, независимо от използвания метод. Не можем обаче да изключим, че използваният метод е твърде нечувствителен, за да демонстрира разлика в индексите на апоптоза между две места на мастната тъкан, което може да корелира с разликата в експресията на cIAP2. Освен това трябва да се изследва физиологичната роля на локалната разлика в експресията на cIAP2 в мастната тъкан.
В обобщение, сравнихме експресията на cIAP2 иРНК в SC и OM мастна тъкан при 12 деца и 11 възрастни. По-висока относителна експресия в OM в сравнение с SC мастната тъкан е установена при деца и възрастни. Това предполага, че диференциалната експресия на cIAP2 между депата може да се дължи на присъщите свойства на клетките от двете депа. По-изразената разлика в педиатричните отлагания при деца може да отразява нетно увеличение на висцералната мастна тъкан по време на растежа.
Благодаря
Тази работа беше подкрепена от Фонда за научни изследвания на Комитета по образование на Джиангсу (320012) и Шведския съвет за медицински изследвания (19X-05708). Благодарим на д-р Xu Xiaoqun, Lou Yao, Chen Yijiang и Prof. Питър Нареди за предоставяне на проба от мастна тъкан за тези изследвания и професор Томи Олсон за ползотворни дискусии.