- абстрактно
- целта:
- методи:
- резултатите:
- заключение:
- Въведение
- резултатът
- Етанолът и диетата с високо съдържание на мазнини увеличават нарушенията на чернодробната функция
- Чернодробна хистология на опитни животни
- C/EBP алфа, бета и делта протеинови експресии в мишки C57BL/6J (B6) с/без етанол и без/високо съдържание на мазнини
- Експресия на протеин на C/EBP алфа, бета и делта в HepG2 клетки с/без етанол
- Експресия на протеин на делта C/EBP в клетки HepG2 с/без олеинова киселина
- Експресия на Delta C/EBP протеин в клетки HepG2, инкубирани с етанол и/или без олеинова киселина
- дискусия
- Принос на автора
абстрактно
Алкохолът, който се метаболизира предимно в черния дроб, е основен токсикат в черния дроб, който лесно предизвиква чернодробна стеатоза. Експресията на свързващия протеин CCAAT енхансер (C/EBP), особено делта сорта C/EBP, се увеличава в ранната фаза на адипогенезата. Ролята на делта C/EBP в индуцираната от етанол хепатостеатоза обаче е неясна.
методи:
Мъжки мишки C57BL/6J бяха разделени на случаен принцип в една от четирите групи: контролна група, перорално приложена етанолова група (4 g етанол/kg телесно тегло) (EtOH), група с високо съдържание на мазнини (HF) и група EtOH + HF група. Мишките се умъртвяват след 5 или 10 седмици за различни измервания. In vitro ефектът на етанола върху експресията на алфа, бета и делта C/EBP е изследван в HepG2 клетки.
резултатите:
До 5-та седмица експресията на делта С/EBP в черния дроб и бета-протеина (съответно 2,3-кратна и 1,4-кратна) се повишава значително при лечение с етанол, който след това се връща до контролните нива до 10-та седмица. Обратно, експресията на C/EBP се увеличи. алфата не беше очевидна до седмица 10. Проучване in vitro показва, че делта експресията на делта C/EBP е значително увеличена след 24 часа, но не и след 48 или 72 часа. C/EBP бета експресията е най-висока след 48 часа, докато C/EBP алфа експресията е най-висока след 72 часа. Също така открихме, че ниските концентрации на етанол плюс олеинова киселина повишават експресията на C/EBP делта в HepG2 клетки.
заключение:
Изглежда, че делта експресията на C/EBP играе важна роля в ранната фаза на индуцирана от етанол хепатостеатоза при мишки и третирани с етанол HepG2 клетки. В допълнение, EtOH + HF увеличава делта C/EBP експресията в HepG2 клетки. По този начин C/EBP делта може да бъде терапевтична цел при алкохолна хепатостеатоза.
Острата или хронична консумация на алкохол може да причини сериозно увреждане на черния дроб 1. Известно е, че алкохолът нарушава окисляването на мазнините и стимулира чернодробната липогенеза 2, 3. Следователно консумацията на алкохол може да доведе до развитие на чернодробна стеатоза. Повечето изследвания върху алкохолната стеатоза на черния дроб са фокусирани върху способността на етанола да измества редокс състоянието в черния дроб и да инхибира окисляването на мастните киселини 3, 4. Всъщност предишни проучвания показват потискане на някои ензими, участващи в окисляването на мастните киселини и индуцирането на липогенни ензими при животни, хранени с етанол 2, 5. Доказано е, че синтезът на новомастни киселини в черния дроб се увеличава с етанол във връзка с индуцирането на адипогенни ензими, включително активиран от пероксизома пролифератор рецептор алфа (PPAR алфа) и/или стерол регулаторен елемент, свързващ протеин 1 (SREBP-1). ) 2, 6. Механизмите, по които етанолът причинява стеатоза, обаче са многобройни и сложни.
CCAAT енхансер свързващи протеини (C/EBPs) са семейство от основни фактори на транскрипция на левцин цип, участващи в регулирането на клетъчната диференциация и функции 7, 8, 9. Описани са шест членове на семейството C/EBP, включително C/EBP алфа, бета, гама, делта, епсилон и зета 10. C/EBP алфа, бета и делта са важни транскрипционни фактори при диференциацията на мазнините. C/EBPs могат да повлияят на адипогенезата чрез регулиране и координиране на каскада от транскрипционни фактори, които заедно водят до образуването на диференцирано състояние 11. Например, C/EBP бета и делта е показано, че се експресират в началото на адипогенезата, докато C/EBP алфа се изразява много по-късно 12, 13. Доказано е, че жизненоважната роля на C/EBP бета и делта в адипогенезата нарушава и двата гена, предотвратявайки нормалното развитие на мастната тъкан 14. В допълнение, делта C/EBP заглушаването нарушава експресията на фактор на диференциация на адипоцитите 49 (fad49), който е увеличен в адипогенезата и изглежда, че играе ключова роля в началото на процеса. .
McKnight et al. 16 показа, че делта C/EBP сам по себе си има минимална адипогенна активност, а делта C/EBP бета и C/EBP играят важна роля за индуциране на C/EBP алфа и PPAR експресия на гама. Lai et al. 17 показа, че индуцирането на делта експресия на C/EBP временно активира PPAR гама 2 транскрипция, която участва в адиопоцитоподобна липогенеза в HepG2 клетки. Времевият профил на експресията на тези три C/EBP изоформи по време на диференциация на мазнините може да отразява основите на регулаторната каскада, която контролира процеса на терминална диференциация на клетките 18 .
Предишни проучвания са изследвали ефекта на етанола върху C/EBP при животни и клетъчни култури, но резултатите са противоречиви 10, 19, 20. Освен това е налице малко или никаква информация за ефекта на етанола върху делта C/EBP. В това проучване проведохме in vivo и in vitro експерименти, за да изследваме промените в делта експресията на делта C/EBP при индуцирана от етанол хепатостеатоза. Ние предположихме, че делта C/EBP е важен транскрипционен фактор при индуциран от етанол хепатостеатоза.
резултатът
Етанолът и диетата с високо съдържание на мазнини увеличават нарушенията на чернодробната функция
След 5 седмично лечение серумните нива на AST и ALT са значително по-високи при мишки в групите EtOH, HF и EtOH + HF, отколкото в контролната група (Р
Хистопатологични промени в черния дроб от мишки C57BL/6J. (A) 5-седмично лечение; черен дроб на контролни мишки (контрол), мишки, на които е даден етанол (EtOH), диетични мишки с високо съдържание на мазнини (HF) или етанол, даван в комбинация с диета с високо съдържание на мазнини (EtOH + HF). (Б) 10-седмично лечение, оцветяване на черен дроб на контролни мишки (контрол), мишки, прилагани с етанол (EtOH), мишки с високо съдържание на мазнини (HF) или етанол, прилагани в комбинация с мишки с високо съдържание на мазнини (EtOH + HF) (HE), × 200).
Изображение в пълен размер
C/EBP алфа, бета и делта протеинови експресии в мишки C57BL/6J (B6) с/без етанол и без/високо съдържание на мазнини
За да се определи дали C/EBPs участват в прогресията на индуцирана от етанол чернодробна стеатоза, ние определихме експресията на C/EBP алфа, бета и делта в черния дроб на мишка след лечение с етанол, със или без HF диета, в продължение на 5 седмици и 10 седмици . След 5 седмично лечение, чернодробната експресия на C/EBP делта е значително увеличена (2,3 пъти) при третирани с етанол мишки в сравнение с експресията при контролни мишки. В допълнение, чернодробната експресия на C/EBP делта при мишки, третирани с EtOH + HF, е по-висока от експресията при мишки, лекувани само с EtOH или HF. Въпреки това, след 10 седмично лечение, експресията на чернодробна делта C/EBP в третирани с EtOH, HF и EtOH + HF мишки беше възстановена за контрол на мишки (Фигура 2А).
Експресия на протеин на делта, бета и алфа CCAAT усилващ протеин (C/EBP) делта, бета и алфа в мишки C57BL/6J, перорално третирани с етанол (4 g/kg BW; EtOH) със или без диета с високо съдържание на мазнини (HF) за 5 или 10 седмици. Горните панели са уестърн петна от делта C/EBP (A), бета (B) и алфа (C). Денситометрично количествено определяне на нивата на протеини (средно ± SD, n = 3-4); стойностите, които не споделят обща буква, са значително различни (P и P> 0,05, b P e P
Експресия на протеин на делта, бета и алфа CCAAT енхансер свързващ протеин (C/EBP) в HepG2 клетки, инкубирани с етанол. HepG2 клетките се третират с различни концентрации на етанол (0, 10, 100, 200 или 400 mmol/l) в продължение на 24 часа. Горните панели са Western blots на делта C/EBP (A), бета (B) и алфа (C). Денситометрично количествено определяне на нивата на протеин (средно ± SD). n = 3-4. a P> 0, 05, b P
Експресия на протеин на делта, бета и алфа CCAAT енхансер свързващ протеин (C/EBP) в HepG2 клетки, инкубирани с/без етанол. HepG2 клетките се третират с 10 mmol/L етанол за 24, 48 и 72 часа. Горните панели са уестърн петна от делта C/EBP, бета и алфа. Денситометрично количествено определяне на нивата на протеини (средно ± SD, n = 3-4); стойностите, които не споделят обща буква, са значително различни (P и P> 0,05, b P
Експресия на протеин на CCAAT, повишаващ свързващия протеин (C/EBP) делта в HepG2 клетки, инкубирани с олеинова киселина. HepG2 клетките се третират с различни концентрации на олеинова киселина (0, 25, 50, 100 или 200 μmol/l) в продължение на 72 часа. Горните панели са уестърн петна от делтата C/EBP. Денситометрично количествено определяне на нивата на протеини (средно ± SD, n = 4); стойностите, които не споделят обща буква, са значително различни. b P c P
Експресия на протеин на CCAAT, повишаващ свързващия протеин (C/EBP) делта в HepG2 клетки. HepG2 клетките се третират с 25 μmol/L олеинова киселина, 10 mmol/L етанол или 25 μmol/L олеинова киселина в комбинация с 10 mmol/L етанол за 24-72 часа. Експресията на протеин, показана в горните панели, е делта C/EBP. Денситометрично количествено определяне на нивата на протеини (средно ± SD, n = 4); стойностите, които не споделят обща буква, са значително различни. b P c P f P 24. C/EBP алфа, бета и делта са важни транскрипционни фактори при диференциацията на мазнините. Ранното изразяване на делта C/EBP е необходимо за ефективно индуциране на C/EBP алфа и PPAR гама 25. Въпреки това, малко се знае дали C/EBPs участват в прогресията на алкохолната хепатостеатоза. В това проучване лекувахме мишки с етанол, за да индуцираме алкохолна хепатостеатоза и установихме, че експресията на делта C/EBP е повишена в ранните стадии на хепатостеатоза, което предполага, че делта C/EBP играе основна роля в прогресията на алкохолната хепатостеатоза.
В това проучване показахме, че приложението на етанол причинява увреждане на черния дроб, както се доказва от повишени серумни нива на AST и ALT и патологични промени, които показват, че липидите започват да се натрупват в хепатоцитите на мишки, лекувани с етанол в продължение на 5 седмици. Мишките, лекувани с етанол в продължение на 10 седмици, развиват по-тежка хепатостеатоза от животните, лекувани в продължение на 5 седмици. ALT е много по-нисък при мишки, лекувани с EtOH + HF, отколкото при мишки, лекувани само с етанол. Предполагаме, че диетата с високо съдържание на мазнини може да предпази от чернодробно увреждане, причинено от етанол, което може да се дължи на намаляване на абсорбцията на етанол в стомаха. По-тежките хепатостеатотични промени в черния дроб на лекувани с EtOH + HF мишки вероятно се дължат на комбинирания ефект на EtOH и HF, както се съобщава в това проучване чрез повишена експресия на делта C/EBP и вероятно други C/EBP.
Показахме, че делта C/EBP участва в прогресията на индуцирана от етанол чернодробна стеатоза и че експресията му е делта по-голяма от C/EBP бета експресията на седмица 5 (2, 3 и 1, 4-кратно увеличение), докато експресията C/EBP алфа не е очевидно до 10 седмица. Интересното е, че чернодробната експресия на C/EBP бета и делта се връща към контролните нива до 10-та седмица. Тези резултати предполагат, че делта C/EBP може да играе важна роля в ранната фаза, но не и в късната фаза на хепатостеатоза, в този модел на мишка. Обратно, C/EBP алфа може да участва в късната фаза на чернодробна стеатоза при мишки.
В клетките на HepG2, инкубирани с олеинова киселина, забелязахме, че експресията на делта C/EBP е значително увеличена. Данните подкрепят виждането, че делта C/EBP участва в адипогенната диференциация 25. Това in vitro проучване разкрива, че ниска концентрация (10 mmol/L) етанол не само увеличава делта експресията на делта C/EBP, но е и синергична с олеиновата киселина при насърчаването на експресията на делта C/EBP в HepG2 клетки. Изненадващо, експресията на C/EBP алфа, бета и делта в HepG2 клетки беше възстановена до ниво, подобно на контролното ниво при по-високи концентрации на етанол (200 и 400 mmol/l). Възможно е ниските и високите концентрации на етанол да повлияят експресията на C/EBP по различни механизми. Подробните механизми, чрез които делта C/EBP се координира с други C/EBP, за да медиира други адипогенни фактори, като PPAR, адипонектин и SREBP, тепърва ще бъдат проучени.
В заключение демонстрирахме увеличаване на делта експресията на делта C/EBP в относително ранната фаза на индуцирана от етанол хепатостеатоза при мишки. Нашето проучване in vitro показва още, че етанол плюс олеинова киселина увеличава експресията на делта C/EBP в клетките HepG2. Тези резултати предполагат, че инхибирането на делта C/EBP е потенциална терапевтична цел при алкохолна хепатостеатоза.
Принос на автора
Проучването е проектирано от Miao-lin HU и Yu-hsuan CHEN; Yu-hsuan CHEN, Chih-min YANG и Shih-pei CHANG извършиха експеримент и анализираха данните; Вестникът е написан от Miao-lin HU и Yu-hsuan CHEN.