Възможности за лабораторна диагностика на инфекции, причинени от Clostridium difficile

Резюме:

Clostridium difficile с производството на токсини е най-честата причина за вътреболнични чревни инфекции. C. difficile колитът е инфекциозно заболяване с различна степен на тежест, може да се прояви като често срещано диарийно заболяване, псевдомембранозен колит, но също и като животозастрашаващо състояние, придружено от паралитичен илеус, прогресиращ до вторичен сепсис. Заболяването най-често възниква във връзка с лечение с широкоспектърни антибиотици, които елиминират нормалната чревна флора. Предаването на C. difficile се осъществява чрез спори по фекално-орален път. Ранното диагностициране на инфекции с C. difficile е важно поради започването на адекватна терапия, както и противоепидемични мерки за предотвратяване на по-нататъшното разпространение на спори в болничната среда.

възможности

Ключови думи: Инфекции с Clostridium difficile, псевдомембранозен колит, лабораторна диагностика, глутамат дехидрогеназа, токсигенен щам

* Всички таблици, графики и фигури, които са част от статията, могат да бъдат намерени в прикачения PDF файл в края на изследването.

Въведение

Патогенеза на заболяването

Епидемиология на заболяването

Терапия

Процедурите за лечение на CDI са залегнали в словашките препоръки за диагностика и лечение на колит, причинен от C. difficile (7). Общите препоръки при лечението на леки форми на CDI са: прекратяване на лечението с ATB, което е причинило инфекцията (ако е възможно), рехидратация, диета без остатъци. При ниски нива на албумин в пациента е необходимо парентерално заместване. Лекарствата, потискащи чревната перисталтика (спазмолитици, опиати), са противопоказани. За лечение на умерени, тежки и рецидивиращи форми на CDI се препоръчва медикаментозно антибиотично лечение: метронидазол, ванкомицин и новия макроцикличен антибиотик фидаксомицин. Пробиотиците се използват като други възможности за поддържащо лечение и в последния период също така т.нар фекална бактериотерапия. Трансплантацията на изпражнения е официално препоръчан метод за лечение на множество рецидиви на CDI с висок процент на успех, който също преодолява съществуващите антибиотични схеми (13).

CDI за лабораторна диагностика

Днес се използват няколко метода за микробиологична диагностика на CDI. Всеки има различна степен на чувствителност и специфичност, така че се препоръчва комбинация. Насочено микробиологично изследване на изпражненията е показано при пациенти с клинично подозрение за CDI. Напротив, той не е показан при пациенти с формени изпражнения и не се прави често при деца под 1-2 годишна възраст.

Доказателство за антиген C. difficile

Глутамат дехидрогеназата (GDH) е специфичен антиген - екзоензим, произведен от всички щамове на C. difficile (токсигенни и нетоксигенни). Доказателство за антиген е възможно директно от изпражненията, специфичността на теста е 80 - 100%. Той има висока отрицателна прогнозна стойност (NPV), t. j. отрицателен резултат най-вероятно изключва възможността за клостридиална инфекция. Тестът обаче не прави разлика между токсигенни и нетоксигенни щамове. Недостатъкът му е и възможността за кръстосана реакция с други видове Clostridium spp. присъства във фекалиите (фалшиво положителен резултат при 20%). GDH може да се определи отделно или като част от тестове, които също откриват токсините на C. difficile.

Доказателства за токсини C. difficile (A/B)

За откриване на A/B токсини се използват диагностични комплекти, базирани на принципа на ензимно свързан имуносорбентен анализ или имунохроматография. В момента на пазара се предлагат редица търговски комплекти с различна чувствителност и специфичност. Тяхното предимство е достъпност, бързина, висока специфичност, опростен дизайн с ясна интерпретация на доказателствата за токсичност на щама. Тестът има висока положителна прогнозна стойност (PPV), t. j. положителен резултат най-вероятно доказва клостридиална инфекция. Недостатъкът е относително ниската чувствителност (90%), което в някои случаи води до фалшиво отрицателни резултати.

Анаеробно отглеждане

Анаеробното отглеждане на C. difficile е доста взискателно и продължително (2-3 дни). За обработка се използват селективни почви, съдържащи цефокситин и циклосерин, които потискат придружаващата флора. Потвърждаването на откриването на културата е възможно микроскопски (ориентационно), биохимично (чрез търговски анаеротести), чрез тест за латексна аглутинация или като се използват по-нови техники (PCR - полимеразна верижна реакция, MALDI TOF MS - матрично подпомагана лазерна десорбционна йонизация-време на полетна масова спектрометрия). Културният тест се счита за необходим за всички проби на изпражненията, при които е потвърдена положителността на GDH, включително изпражнения с отрицателен токсин. Имунохимични анализи или PCR могат да се използват за откриване на токсини от отглежданата култура. Предимството на изследването на културата е неговият висок добив, възможността за съхраняване на изолирани култури, определяне на чувствителност към антибиотици (ATB) или молекулярно типизиране (епидемиологични цели).

Демонстрация на цитотоксичност в тъканни култури

Доказателствата за цитотоксичност в тъканните култури имат по-скоро историческо значение. Този метод отнема време, лабораторно оборудване и интерпретационен опит, неговият недостатък е рискът от фалшива положителност. Чувствителността се отчита като 94-100%. Цитотоксинът може да бъде открит във фекалиите или от изолиран щам difficile върху култури на фибробластни тъкани, където се появява цитопатичен ефект.

PCR - доказателства за токсичност на гени

Въвеждането на PCR методи, независимо дали като скринингови или потвърждаващи методи, при диагностицирането на CDI е европейска тенденция. Те се характеризират с висока чувствителност (99 - 100%) и специфичност, значително съкращавайки времето за получаване на резултата. Стойността на PPV е парадоксално намалена, тъй като PCR е толкова чувствителна, че дори малко количество токсиген C. difficile, присъстващо при нормална колонизация, може да бъде открито в пробата, като по този начин не се прави разлика между колонизацията и инфекцията (14). Днес имаме търговски комплекти (базирани на принципа на PCR в реално време) за откриване на гена за производство на токсин В, гена на бинарния токсин, комплекти за откриване на делеции, типични за някои епидемични PCR риботипове (напр. 027, 176). PCR е особено важен за проверка на тежките форми на CDI и за потвърждаване на неясните резултати от предишни тестове.

Пишете C. difficile за епидемиологични цели

Разширените диагностични методи включват риботипиране и токсинотипиране, които се основават на PCR и анализ на макрорестрикция чрез импулсна гел електрофореза (2). По време на риботипирането на C. difficile се усилва регионът между гените за 16S и 23S рРНК (т.нар. Intergenic Spacer Region). Има разлика между отделните риботипове в броя на алелите на тези гени и в дължините на участъците между алелите (6). Всеки RT формира специфичен електрофоретичен профил, според който впоследствие се идентифицира. За да се определи конкретна RT, получените електрофореограми се сравняват с австрийската уеб база данни https://webribo.ages.at/. Общо бяха открити над 800 PCR риботипа и 24 токсинотипа.

Препоръчителна диагностична процедура

Материал и методология

Абонамент биологични материал и транспорт до лабораторията За микробиологично изследване на фекалиите за наличие на C. difficile трябва да се вземат минимум 2 ml фекалии в стерилен контейнер. Изпражненията трябва да бъдат обработени и изследвани в рамките на два часа, тъй като токсините са относително нестабилни, бързо се разпадат и могат да доведат до фалшив негатив. Ако не е възможно да се изследват изпражненията веднага след събирането, препоръчително е пробата да се държи при температура в хладилника (около 5 ° C), след което стабилността на токсина се осигурява за 48 часа. За дългосрочно съхранение на пробите пробата на изпражненията трябва да бъде дълбоко замразена при -70 ° C.

Резултатите

Общо 481 изпражнения с диария от 3 болници са изследвани за 5 месеца. Даден е преглед на отделните отдели, от които са получени изследваните проби в таблица 1. От общия брой изследвани изпражнения 104 проби от GDH са положителни (21,6%). След отстраняване на неуспешно култивирани, дубликат, респ. трикратни проби останаха в комплекта от 66 проби (66 пациенти). Изолатите на C. difficile от тези изпражнения бяха подложени на молекулярно типизиране. От 66 проби 58 (87,9%) са токсигенни (присъстват гени tcdA и tcdB), от които 6 изолати също имат бинарни токсин гени (cdtA, cdtB). Останалите 8 проби от набора (12,1%) са нетоксични, т.е. j. те не показаха наличието на нито един от гените за производство на токсини. Използвайки 3-стъпков диагностичен алгоритъм и комбинация от други методи (имунохроматографско определяне на токсини и откриване на токсигенност чрез PCR), беше установено, че от 58 токсиноположителни изпражнения, 35 проби имат положителен токсин директно от изпражненията и 23 проби ( токсин-отрицателен от изпражненията) към токсигенна културата потвърждава положителността на токсините (Таблица 2).

Заключение