срещу

  • елементи
  • абстрактно
  • Заден план:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Основното
  • Материали и методи
  • Пациенти, хистопатологична оценка и проследяване
  • Количествени интрахепатални измервания на HBV ДНК и cccDNA
  • Анализ на генната експресия чрез RNA-секвенция
  • Статистически анализ
  • Одобрение на проучването
  • резултатът
  • Характеризиране на вирусното натоварване на HBV в тумор и сдвоени не-неопластични черен дроб
  • По-висок брой копия на cccDNA при по-малки тумори в сравнение с по-големи тумори
  • Интрахепатален вирусен товар и вирусна активност на базата на серумни HBV DNA и HBeAg
  • Влияние на активността на вирусната репликация в туморен и неопластичен черен дроб върху оцеляването на пациента и рецидив на HCC
  • Експресия на ген, свързана с активност на вирусната репликация в не-неопластичен черен дроб
  • Вирусен генотип и варианти на туморна и неопластична чернодробна тъкан
  • дискусия
  • История на промените
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителни материали и методи
  • PDF файлове
  • Допълнителни таблици 1-8

елементи

  • ДНК репликация
  • Жълтеница тип Б
  • Хепатоцелуларен карцином
  • Туморни вирусни инфекции

Тази статия е актуализирана

абстрактно

Заден план:

Целта на това проучване е да се определи ефектът на вътреклетъчната ДНК на вируса на хепатит В (HBV), ковалентно запечатана кръгова ДНК (cccDNA) и активността на вирусната репликация както в тумора, така и в не-неопластичния черен дроб върху прогнозата и да се определи връзката между активността на вирусната репликация и Ishak фиброза. при прогнозиране на резултата след резекция.

методи:

Включени са общо 99 потенциално записани пациенти, лекувани с първична чернодробна резекция за HBV-HCC. Вътреклетъчната HBV ДНК и cccDNA се определят количествено чрез PCR в реално време. РНК секвенирането (RNA-seq) се извършва при подгрупа от 21 пациенти, които имат или минимална чернодробна фиброза (Ishak етапи 0-2), или краен стадий фиброза (Ishak етап 6).

резултатите:

Туморната тъкан съдържа по-ниски cccDNA копия в сравнение с сдвоени не-неопластични черен дроб, а по-големите тумори (> 3 cm) имат по-малко cccDNA в сравнение с малките тумори (-3 cm). Високата активност на репликация на вируса в неопластичния черен дроб е свързана с по-висок процент на рецидив на HCC, независимо от стадия на фиброза на Ishak. Гените, които корелират с вирусна репликативна активност в не-неопластичния черен дроб (620 гена), са различни от гените, свързани с фиброза в краен стадий (1226 гена). Гените, свързани с вирусна репликативна активност, са разпределени за предпочитане в регионите chr3, chr16 и chr19.

заключение:

Активността на вирусната репликация в неопластичния черен дроб е свързана с рецидив на HCC чрез механизми, които са различни от етапа на фиброза на Ishak и са независими от етапа на фиброза на Ishak.

Основното

Вирусът на хепатит В (HBV) е ДНК вирус с обвивка, който инфектира предимно хепатоцитите. В случай на зрял вирион, вирусната ДНК присъства в освободена кръгова форма (rcDNA), която е частично двуверижна. При влизане в клетката гостоприемник, вирусният геном се транспортира до ядрото, където rcDNA се превръща в ковалентно затворена кръгова ДНК (cccDNA) (Levrero et al, 2009). След като се образува, съдържанието на cccDNA е стабилно в неподвижни хепатоцити и може да бъде намалено чрез разреждане чрез клетъчно делене, убиване на заразени клетки или потискане от антивирусни цитокини (Belloni et al, 2012).

Персистиращата HBV инфекция е основен рисков фактор за развитието на HBV-асоцииран хепатоцелуларен карцином (HCC). Вирусните протеини, интеграция на вирусния геном в генома на гостоприемника, възпаление, оксидативен стрес и продължителни фиброзни реакции, свързани с хронична HBV инфекция, могат да играят всички важни роли в хепатокарциногенезата (Xu et al., 2010; Zhou et al., 2010; Arzumanyan и др., 2010) .Нашите предишни проучвания показват, че финалната фиброза (Ishak фаза 6) е независимо свързана с лоша обща преживяемост и по-висок процент на рецидив на HCC (Wang et al., 2013b, 2013c). В допълнение, предишното ни проучване, използващо неинотластични вградени в парафин чернодробни тъканни проби от 111 пациенти с HBV-HCC, лекувани между 1991 и 2008 г., показа, че активността на вирусната репликация, както се посочва от дела на cccDNA в общата HBV ДНК, корелира с некротично възпаление и Фиброзен стадий на Ishak и че високата активност на репликация на вируса в неопластичния черен дроб е свързана с лош резултат при пациенти с HBV-HCC (Wang et al, 2013c).

Целта на това проучване е да се определи дали ефектът от активността на вирусна репликация на HBV върху резултата се медиира от механизми, независими от фиброза или вторични. Този доклад описва резултатите от обещаваща кохорта пациенти, напълно различни от предишната ретроспективна кохорта. В това проучване са включени само данни, получени от проби от прясна тъкан, получени от пациенти с първична чернодробна резекция, включени в проучването между 2008 и 2013 г. Вътреклетъчната HBV DNA и cccDNA и вирусната репликативна активност (съотношение cccDNA/HBV DNA) са измервани с помощта на стандартизирана качествена PCR (Laras et al., 2006; Volz et al., 2007; Pollicino et al., 2011) и сравнени в 99 сдвоени тумори и не-неопластични чернодробни тъканни проби от пациенти с HBV-HCC. Ефектът на вътреклетъчната вирусна ДНК и репликацията на вируса върху клиничния резултат след хирургична резекция за лечение.

Материали и методи

Пациенти, хистопатологична оценка и проследяване

Това е проспективен анализ на 99 пациенти с HBV-HCC, претърпели първична хирургична резекция с намерение в Медицинския център на планината Синай в Ню Йорк от 2008 до 2013 г. От тези пациенти 90% документираха антивирусна терапия и повечето бяха лекувани за кратък период от време време преди тяхната HCC диагноза. Повечето пациенти са получили един вид антивирусно лечение (82%), 17% са получили два вида антивирусно лечение, а 1% са получили три вида антивирусно лечение. Най-често използваните антивирусни средства са ентекавир (39%), тенофовир (34%) и адефовир (23%). Други антивирусни средства, като телбивудин, представляват 4% от всички видове антивирусно лечение. Предоперативната серумна HBV ДНК се определя от медицинско досие. В нашите институционални клинични лаборатории серумните нива на HBV ДНК се определят количествено, като се използва HBV AmpliPrep-COBAS TaqMan HBV анализ с докладван диапазон от 23-2 х 108 IU ml -1 (Faria et al, 2008). Средното проследяване на оцелелите е 30 месеца.

Чернодробни резекционни проби бяха оценени от един чернодробен патолог. Степента на чернодробна фиброза в не-неопластична чернодробна тъкан се оценява, като се използва модифициран метод на Ishak (етапи 0-6), както следва: степен 0 (нормален черен дроб); степен 1 ​​(удължаване на няколко портални тракта чрез фиброза); етап 2 (фиброза на всички портални трактове); Етап 3 (влакнесто разширение на повечето зони на портала с случайно свързване на портала с портала); етап 4 (влакнесто разширение на портални зони със значително преодоляване); етап 5 (маркиран с мостове от случайни възли); и етап 6 (демонстрирана цироза с нодуларна тъкан) (Goodman, 2007; Wang et al, 2013b). Пациенти с множество тумори не бяха изключени от това проучване. Патологът оцени индекса на хистологичната активност (HAI, резултат от 0 до 18), представляващ степента на невъзпалителна степен, туморната диференциация и съдовата инвазия.

Подробна методология за диагностика и последващи мерки на пациента е дадена в допълнителни материали и методи.

Количествени интрахепатални измервания на HBV ДНК и cccDNA

HBV ДНК и cccDNA се амплифицират от геномна ДНК, използвайки QIAamp ДНК екстракционен комплект, както е описано по-рано (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ) (Kuang et al., 2010; Schrader and Iredale, 2011; Wang et al., 2013c). Подробна методология е включена в допълнителните материали и методи.

Анализ на генната експресия чрез RNA-секвенция

Експресията на гените беше оценена при подгрупа от 21 пациенти, използващи RNA-seq технология в не-неопластичния черен дроб (Допълнителна таблица 3). Включени са всички пациенти с размер на тумора под 5 cm, или с минимална чернодробна фиброза (Ishak етапи 0–2, n = 10) или с вероятна или окончателна цироза (Ishak степен 6, n = 11). Обща РНК (1-3 μg на проба) беше подадена в Core Sinai Genomics Core Facility за анализ на контрола на качеството. Подробна методология за RNA-seq е включена в допълнителните материали и методи.

Нивото на генна експресия се изчислява с помощта на RPKM (стойности на килобаза на модела на екзон на милион картографирани показания), които се нормализират спрямо дължината на гена и общите картографирани показания в една проба. Гени, които корелират с вирусна репликативна активност, са идентифицирани с помощта на корелационния тест на Spearman. При P 100 пъти, от 6607 × 103 копия до 46 × 103 копия, което показва ефикасността на лечението с DNase. Броят на HBV ДНК копия в същата група проби намаля от 22 х 103 копия на 3 х 103 копия, отразявайки седемкратно намаляване. Броят на копията на cccDNA намаля от 1 x 103 копия на 0,3 x 103 копия, отразявайки тройно намаление. Следователно, PCR-базиран анализ усилва както вирусния геном, така и интегрираната вирусна ДНК.

По-висок брой копия на cccDNA при по-малки тумори в сравнение с по-големи тумори

Първоначалните тумори (по-малки от средните, -3 cm) имат по-голям брой копия на cccDNA на клетка в тумора в сравнение с по-големи тумори (> 3 cm) (средно: 0 0004 копия на клетка, n = 57, в сравнение с 0 копия на клетка, n = 42) (Фигура 1А). За разлика от това, броят на копията на cccDNA в не-неопластичния черен дроб на пациенти с малки срещу големи тумори не се различава. При пациенти с малки тумори броят на cccDNA копията не се различава между тумора и сдвоения неопластичен черен дроб, докато при пациенти с по-големи тумори копието на cccDNA на тумора е значително по-ниско от сдвоения неопинетичен черен дроб. Подобни находки са наблюдавани за интрахепатална HBV ДНК (Фигура 1В). Малкият тумор и големите тумори не се различават по активност на репликация на вируса (средно съотношение cccDNA/HBV DNA: 0,09 при малък тумор срещу 0,06 при по-големи тумори).

Малките HCC (-3 cm) имат по-високи cccDNA и HBV DNA копия в сравнение с големите HCC (> 3 cm). Графика, показваща копие на cccDNA на клетка ( A ) или копие на HBV ДНК на клетка ( Б. ) в тумора (плътни решетки) или не-неопластичен черен дроб (отворени решетки) при пациенти с малък HCC (-3 cm) или голям HCC (> 3 cm).

Изображение в пълен размер

Туморните cccDNA копия не се различават в сравнение с туморната диференциация, съдова инвазия или производството на α-фетопротеин (данните не са показани).

Интрахепатален вирусен товар и вирусна активност на базата на серумни HBV DNA и HBeAg

От пациентите в това проучване 90% документират антивирусна терапия. Въпреки антивирусното лечение, 49% от пациентите са имали откриваема серумна HBV ДНК и 96% от откритата HBV ДНК в чернодробната тъкан по време на чернодробна резекция. Съотношението на HBV DNA, cccDNA и cccDNA/HBV DNA в туморен или не-неопластичен черен дроб не се различава при пациенти с неоткриваемо в сравнение с пациенти с откриваема серумна HBV DNA (допълнителна таблица 2).

Статусът на HBeAg непосредствено преди операцията е бил достъпен за 67 пациенти (76% са били HBeAg отрицателни, докато 24% са били HBeAg положителни) (Допълнителна таблица 2). Съотношението cccDNA/HBV DNA в не-неопластичния черен дроб е значително по-високо при HBeAg-отрицателни пациенти, което показва по-ниска репликационна активност в чернодробната тъкан, докато всички останали вирусни свойства не се различават. В допълнение, делът на HBeAg отрицателните пациенти е значително по-висок при пациенти с ниска HBV репликативна активност в неопластичния черен дроб в сравнение с пациенти с висока HBV репликативна активност (93% срещу 62%, P = 0,004) (Допълнителна таблица 3). Следователно, само репликационната активност на HBV в неопластичния черен дроб корелира със серумния HBeAg статус.

Влияние на активността на вирусната репликация в туморен и неопластичен черен дроб върху оцеляването на пациента и рецидив на HCC

Общият 5-годишен процент на преживяемост при 99 пациенти е 72%, а процентът на рецидиви на HCC е 44% според анализа на Kaplan-Meier. Повечето рецидиви са настъпили в рамките на 24 месеца след хирургичната резекция. Ефектът на общата вътреклетъчна HBV ДНК, cccDNA и репликационната активност както в туморната, така и в не-неопластичната чернодробна тъкан върху резултата беше изследван чрез сравняване на групите по средни гранични стойности (Таблица 2 и Фигура 2А и В). Няма вирусни характеристики в тумора или неопластичния черен дроб, свързани с общата преживяемост.

Маса в пълен размер

Влияние на активността на вирусната репликация (съотношение cccDNA/HBV DNA) по време на чернодробна резекция върху общата преживяемост и честотата на рецидиви след резекция. Обща преживяемост ( A ) и честота на рецидиви ( Б. ) стратифицирана по средната граница на съотношение cccDNA/HBV ДНК в тумор или неопластичен черен дроб е конструирана по метода на Kaplan-Meier и сравнена с помощта на log-rank тест или тест на Wilcoxon.

Изображение в пълен размер

Активността на вирусната репликация в не-неопластичен черен дроб е свързана с честотата на рецидиви на HCC (Таблица 2 и Фигури 2А и В). Високата активност на репликация на вируса (по-ниско съотношение cccDNA/HBV DNA) в не-неопластичния черен дроб е свързана с по-висока честота на рецидиви (Фигура 2В). Високата активност на репликация на вируса (по-ниско съотношение cccDNA/HBV DNA) в не-неопластичния черен дроб също е свързана с по-високи HAI (4, 1 срещу 3, 4, P = 0,04) и по-висок стадий на фиброза (4, 7 срещу 3, 9, P = 0,01), което е в съответствие с предишното ни проучване в ретроспективната кохорта (допълнителна таблица 3). Когато етапът на фиброза беше добавен като ковариант, активността на репликация на вируса в неопластичния черен дроб все още беше значително свързана с рецидив на HCC чрез регресия на пропорционалните рискове на Cox (HR: 2, 1 (1, 0–4, 5), P = 0.04), което предполага, че активността на вирусната репликация допринася за рецидив на HCC, независим от фиброза.

Експресия на ген, свързана с активност на вирусната репликация в не-неопластичен черен дроб

Предполагаме, че активността на вирусната репликация и фиброзата в неопластичния черен дроб могат да повлияят на различни биологични пътища, участващи в рецидив на HCC. След това генни подписи, свързани с вирусна репликативна активност или чернодробна фиброза в неопластичния черен дроб, бяха анализирани в подгрупа от 21 пациенти, използващи RNA-секвенция. (Допълнителна таблица 4). От тези пациенти 10 са имали минимална фиброза (стадии Ishak 0-2), докато 11 са имали фиброза в краен стадий (стадии Ishak 6). Всички 21 пациенти са имали HCC −11), което е набор от надолу регулирани гени, когато локусът ZNF217 е бил усилен при 20q13. рак (Ginestier et al., 2006). ZNF217 е протеин с цинков пръст, който често се усилва при 20q13 при рак на гърдата (Krig et al., 2010). Цинковите протеини на пръстите като цяло са обогатени в геновия набор VRAA (1,6-кратно обогатяване, P = 0,01).

Има 1226 гена, които са били диференцирано експресирани в неопинетичния черен дроб на стадии Ishak фиброза 0–2 в сравнение с Ishak етап 6 (Допълнителна таблица 6). Тези гени са функционално обогатени за три сигнатури, свързани с рака на черния дроб (допълнителна таблица 7). Гените, свързани с фазата на фиброза на Ishak, леко се припокриват с гените в набора от гени VRAA и са идентифицирани само 26 общи гена (допълнителна таблица 8).

Също така беше определено дали тези диференциално експресирани гени са обогатени при някакви хромозомни позиции. Гените VRAA са обогатени в областите chr19, chr16 и chr3 (P

Туморът има по-ниско копие на cccDNA на клетка в сравнение с неопластичния черен дроб. Това може да се дължи на разреждане чрез разделяне на туморни клетки. В миши модел на активатор на плазминоген урокиназа/тежка комбинирана имунна недостатъчност (SCID), пролиферацията на хепатоцити индуцира загуба на cccDNA (Lutgehetmann et al, 2010). Изследвания върху модел на патици показват, че антивирусната терапия предизвиква по-голямо намаляване на cccDNA при животни с по-висока пролиферация на хепатоцити (Addison et al, 2002). Нашите данни също така предполагат роля за клетъчното делене при регулирането на броя на копията на cccDNA, тъй като е установено, че малките тумори съдържат по-висок брой копия на cccDNA в сравнение с големите тумори; и при пациенти с малки тумори броят на копията на cccDNA в тумора не се различава от броя на сдвоените не-неопластични черни дробове.

Нашето наблюдение на по-ниски нива на cccDNA в тумора е в съответствие с неотдавнашен доклад на 42 пациенти с HBV-HCC (Wang et al., 2013a), но се различава от по-ранен доклад с 25 пациенти с HBV-HCC, които имат по-голям брой копия на cccDNA в тумора като пациенти без неопластичен черен дроб (Wong et al., 2006). Причините за разликите от предишното проучване не са ясни, въпреки че нашето изследване е определило количествено броя на копията на HBV DNA и cccDNA на клетка, като е измерило и нормализирало броя на копията на албумин във всички проби и не е изчислило броя на клетките въз основа на оценка от 6.667 pg геномна ДНК на клетка (Wong and col., 2006).

Нашите предишни ретроспективни проучвания показват, че активността на репликация на вируса в неопластичния черен дроб е свързана с лоша обща преживяемост след хирургична резекция, но не и с преживяемост без рецидиви. Настоящото изследване се различава от това по няколко начина. Това настоящо проучване включва пациенти с хирургична резекция от 2008 до 2013 г., докато предишното проучване включва пациенти от 1991 до 2008 г. Трябва да се отбележат и някои разлики, като по-малкия размер на тумора в настоящото проучване (4, 3 ± 3, 6 срещу 7,3 ± 5, 0 cm). В настоящото проучване вирусната ДНК беше измерена с помощта на пресни проби от хирургична резекция, докато в предишното проучване вирусната ДНК беше измерена с помощта на ДНК, изолирана от архивирани парафинови блокове. Въпреки всички тези разлики, настоящото проучване потвърждава предишните ни наблюдения, че активността на вирусната репликация корелира със стадия на HAI и Ishak и че високата активност на вирусната репликация е свързана с лош резултат. Тъй като тези пациенти продължават да бъдат наблюдавани, въздействието на активността на вирусната репликация върху преживяемостта без рецидиви и общата преживяемост ще бъде допълнително оценено.

В обобщение, това проучване предоставя директно сравнение на вътреклетъчната HBV ДНК, cccDNA и активността на вирусната репликация в туморен и непластичен черен дроб. Данните показват, че високата репликационна активност в не-неопластичния черен дроб е свързана с по-висок процент на рецидив на HCC чрез механизми, които са различни и независими от стадия на фиброза на Ishak.

История на промените

Допълнителна информация

Word документи

Допълнителни материали и методи

PDF файлове

Допълнителни таблици 1-8

Това произведение се публикува въз основа на стандартен лиценз за публикуване на договор. След 12 месеца произведението става свободно достъпно и лицензионните условия преминават към непубличен лиценз Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 4.0.