елементи

абстрактно

Точността на търсенето на аксонални пътища и формирането на функционални нервни вериги са от решаващо значение за тялото да обработва, съхранява и извлича информация от вътрешни мрежи, както и от околната среда. Смята се, че вариациите в миграцията на аксоните водят до образуване на вериги и самофасцикулация, което може да доведе до силно дисфункционална нервна система и поради това се смята, че регулаторният механизъм за контрол на синаптогенезата е самоограничаване на аксоните. Тук представяме приложението на новоразработен безконтактен оптичен метод, използващ слабо фокусиран, инфрачервен лазерен лъч за високоефективно насочване на аксоните и демонстрираме образуването на аксонови бримки в кортикалните неврони, които показват, че самите кортикални неврони могат да фасуцират за разлика до самоизбягване. Способността на светлината да образува аксонална нано-верига отваря нови пътища за изграждане на сложни невронни вериги и неинвазивно провеждане на неврони на дълги работни разстояния за възстановяване на повредените невронни връзки и функции.

В допълнение към топографски 17 и химически 18 стимули са използвани голямо разнообразие от други иновативни методи, включително електрически 19, оптични 20, 21, 22, 23 и хибридни подходи като електрохимични 24, оптофлуидни потоци 25 и фотохимични 26 стимули . за целите на аксоналното ориентиране. Въпреки че съществуващите оптични методи се основават на принципите на атрактивното проводимост, ние открихме, че лазерните лъчи с близка инфрачервена светлина (NIR) могат да действат като отблъскващи сигнали 27, 28. В този случай използвахме слабо фокусиран NIR лазерен лъч, за да направляваме кортикалните аксони на плъхове по много ефективен начин, което ни позволи да образуваме бримки с различни радиуси и да наблюдаваме аксоналната фасцикулация за първи път. Благодарение на ускореното внедряване и интегриране на тази технология с други инструменти за оптични манипулации и изображения, ние представляваме ефективен инструмент за изграждане и изследване на основни градивни елементи на невронни вериги in vitro с висока точност и накрая за разбиране и управление на сложни невронни вериги in vivo в пространствени и времеви области. В крайна сметка този метод може също да предостави нови възможности за лечение на нарушения на нервната система, свързани с неправилно подравняване на аксоните.

Резултати и дискусия

Въпреки че е доказано, че светлината действа като привлекателен етикет, докато удря директно конуса на растежа (със специфични планове за облъчване), ние използваме ефекта от разстоянието, използвайки слабо фокусиран NIR светлинен източник, който в момента смятаме, че е фототермален. 28, 29. Аксоните със скорост на растеж> 20 μm/h бяха избрани на случаен принцип за образуване на контури. Освен това лазерното петно ​​не се прилага само на напречното разстояние (2 - 8 μm) от растежния конус (GC), но ниската обективна NA (0,5 NA, 20 × микроскопска цел) е на аксиалното разстояние

контур

а) Оптична линия с екологична камера. (b) Ляв панел: изображение на типичен аксон преди и след завой. Позицията на лазерната точка се обозначава с червен кръг. Десен панел: забавено припокриване на аксоналния вал след взаимодействие с лазерния лъч. Посоката на първоначалния конус на растеж, посочена със стрелка. Псевдоцветни линии, начертани през аксоналния вал в различни моменти от време и се припокриват. Интервалът от време между цветовете е 2 минути в цветната лента.

Изображение в пълен размер

а) Фазово контрастни изображения на два кортикални неврона на плъхове (а) преди и (б) след оптично насочване. Правоъгълник, показващ интересуващата област за оптично насочване. Скала: 50 μm. (c - k) Снимки с интервал от време на оптично изработен аксонен контур, показващ позициите на лазерните точки (червени кръгове) (l - n) Самофасцикулация на аксона. Скала: 10 μm.

Изображение в пълен размер

Образуването на цикъла (фиг. 2к) демонстрира безпрецедентната способност на този отблъскващ метод на оптична реплика да постигне пълно кръгово насочване без никакви топографски граници, което трябва да позволи създаването на сложни невронни вериги in situ. Интересното е, че радиусът на кривината на контура, образуван по този метод, може да се наблюдава като

5 μm (равен на най-малкия радиус, открит в произволни контури, спонтанно образувани in vitro, Suppl. Фиг. 1). След образуването на оптично направлявана верига (фиг. 2k), въпреки че предполагахме, че GC ще напредне през оригиналния аксонен вал, оптически управляваният кортикален аксон на плъха продължава да расте рамо до рамо, като саморазливането се наблюдава на дълги разстояния и във времето (Фиг. 2 l). - n). Това ни кара да вярваме, че хипотезата за самоограничение може да не е универсална за всички видове аксони и че специфични неврони могат да я използват в своя полза, за да образуват фасцикули със себе си, като по този начин намаляват синаптогенезата 16. Доп. Филми 3 и 4 показват увеличената площ и цялото зрително поле на образуването на О-верига и процеса на самофаскулация чрез модулация в пространство-време на индуцираната от лазера отблъскваща реплика. Псевдоцветните наслагвания на контура на аксоналния вал, взети от процеса на образуване на контура, са показани в Suppl. Фиг.

а) Кинетика на ъгъла на въртене на кортикалния аксон, контролиран от лазер с помощта на леща с 20x микроскоп. (б) Кумулативни графики за разпределение на лазерно ориентирани аксонални ъгли на въртене. в) Кинетика на нетния растеж на аксоните по време на оптично насочване. (г) Скорост на растеж по време на многоетапно въртене на модулирания във времето лазерен лъч. (д) Изображения на аксонална проводимост с интервал от време (3 минути), използвайки пространствено оформен профил на лъча (маркиран с червена линия). Скала: 10 μm.

Изображение в пълен размер

По-нататък изследвахме дали аксоновите бримки могат да се образуват с по-малки радиуси на кривина с помощта на импулсна светлинна табела и дали самофасцикулацията на кортикалния аксон се модулира от такова рязко завъртане. На фиг. Фигура 4А показва изображения с интервал от време (а - j) на лазерно подпомогнато производство на аксонална верига с радиус на кривина 5 μm) е установено, че е стабилна, стабилността на по-малките контури намалява с намаляващ радиус на контура (фиг. 4С).

(А) Изграждане на I-контура чрез метода на лазерно аксонално насочване. (a - j) Фазово контрастни изображения на оптично изработен I-контур с времеви интервал (3 минути) на пълно сглобяване на кортикалния аксон обратно към неговата ос. Скала: 10 μm. (Б) Производство на електронни вериги с помощта на лазер. (а - г) Фазово контрастни изображения на оптичното изпълнение на цикъла в кортикалния неврон на плъх (4 минути). (д - з) Самопочистване на оптично направлявания аксон и намаляване на радиуса на кривина на оптично направения контур. Скала: 10 μm. Позициите на лазерната точка са обозначени с червени кръгове. (C) Кинетика на промяната на диаметъра на контура за аксонови контури с различни радиуси. (D) График на радиуса спрямо еквивалентна сила за аксони с различен брой микротубули (10-100 на стъпки от 10). Вертикалните линии (червено: I-loop, черно: e-loop, синьо: o-loop) показват трите постигнати крайни радиуса на кривина на аксоновите контури.

Изображение в пълен размер

(А) Поредици от фазово контрастни изображения с интервал от време, демонстриращи предотвратяване на проспективно образуване на верига чрез отблъскваща оптична реплика в кортикални аксони на плъхове (лазерна точка, маркирана с червен кръг) Лазерното петно ​​беше преместено след 8 минути и изключено след 23 минути. Наблюдава се, че Аксон е очарован от себе си по време на периода на наблюдение след 26 минути. (B) Относителна динамика на ъгъла, завъртяна по време на предотвратяването на контура поради първоначалната (къса червена стрелка) и вторичната (дълга червена стрелка) оптични линии. (C) Динамика на относителната дължина по време на предотвратяване на контура поради първоначалните (къса червена стрелка) и вторичните (дълга червена стрелка) оптични линии. Краят на оптичната линия е маркиран с черна стрелка.

Изображение в пълен размер

С неотдавнашния напредък в новите оптични инструменти за пейсмейкър и изображения 40 би било възможно да се извърши неинвазивно изцяло оптично тестване на изчислителната природа на оптично генерирана невронна верига. В допълнение, с помощта на инфрачервен лазер за използване при сенсибилизиране на неврони чрез трансфекция на гени, кодиращи опсин 46, както и две фотонни оптогенетични стимулации 40 и оптично изображение 40, 41, може да се постигне бърз напредък в изцяло оптичния контрол на образуването и активността на невронната верига. Въпреки че е установено, че тази отблъскваща насока е повсеместна за различни типове неврони (ганглийни клетки на златни рибки, кортикални неврони на плъхове и ганглиозни клетки на дорзален корен), с интегрирането на био и конформни нанофотонни технологии 47, нови възможности за генетично сенсибилизиране на специфични неврони ще реагират на специфични дължини на лазерните вълни и по този начин селективно ги провеждат in vivo .

заключения

методи

Експерименталните процедури, описани в този ръкопис, са извършени според Тексаския университет в протокола на Институционалния комитет за грижа и употреба на животните в Арлингтън.

Култура на кортикални неврони

Всички експериментални процедури бяха извършени съгласно протокола на Институционалния комитет по грижа и употреба на животните. Невроните на кората са изолирани от ембрионални ембриони на плъхове в продължение на 18 дни. Кортикалните тъкани бяха отделени, изчистени (менингеален слой), ензимно дисоциирани (0,15% трипсин в L-15 среда) в продължение на 20 минути при 37 ° C. Дисоциирани кортикални неврони (100 000/устройство) бяха инокулирани върху поли-D-лизин (PDL, 0,01%, Sigma) предварително покрито покривно стъкло с полидиметилсилоксанова бариера (Sylgard 184, Dow corning) и безсерумна културална среда (невробазална среда). допълнен с B-27 с BDNF и NT-3, 10 ng/ml) се променя на всеки 3 дни.

Настройки за аксонална навигация

Схема на платформата за аксонална навигация е показана на ФИГ. 1а. Регулируемият инфрачервен лъч Ti: Sapphire (MaiTai HP, Newport-SpectraPhysics), който работи в изключен режим, е удължен и предаден чрез сгъване на огледала към задния лазерен порт на обърнат микроскоп (Ti-U Eclipse, Nikon). ). Механичен затвор (Uniblitz) е използван за пулсиране на лазерния лъч (20 ms ON и 20 ms OFF), за да се предотврати непрекъснато повишаване на температурата или механична принуда. Използвано е дихроично огледало за насочване на лъча в задната апертура на обектива с 20x микроскоп (Ph1, NA = 0,5, Nikon), предаващ видима светлина за показване на фазовия контраст. В образната пътека беше използван IR прекъсващ филтър за отстраняване на отразения лазерен лъч, за да се постигне CCD (Фотометрия). Дължината на вълната и мощността на лазерния лъч бяха коригирани чрез софтуер, за да се постигне мощност на лъча на пробата-80 mW. Лазерната мощност в равнината на пробата се изчислява чрез умножаване на целевия коефициент на предаване по мощността, измерена в задната апертура на обектива на микроскопа, като се използва стандартен измервател на мощността на светлината (PM 100D, Thorlabs). За да се постигне оптично насочване, лъчът беше поставен извън филоподиите на аксоните, асиметрично поставен по пътя на нарастващите аксони.

Измерване на ориентацията на конуса на растежа

Първоначалната аксонална ориентация е посочена като еталон и следните клонове са измерени по отношение на тази начална позиция. Прилагайки сила върху конуса за растеж, конусът за растеж също предотвратява лазерното петно. За целта е установено, че GC не само се обръща от лазерната точка, но и се връща назад. Тази динамика на въртене е определена количествено чрез записване на промяната в проекцията на растежния конус върху равна повърхност с помощта на софтуера Image J. Всеки път, когато GC се издигне от повърхността, виждаме само прогнозираните дължини в посоките X и Y. можем лесно да достигнем ъгъла на въртене.

Теоретично изчисление на еквивалентната сила, необходима за определяне на радиуса на огъване в аксоналната посока

Микротубулите са дълги влакна, които служат като пътища за междуклетъчни двигателни протеини и улесняват структурните функции в еукариотните клетки. В типичен аксон се смята, че 10 до 100 такива микротубули присъстват във всяко дадено напречно сечение на аксоналния вал. Процесите на полимеризация на конуса на аксоналния растеж се асиметрично модулират от фототермичен градиент, генериран от близкия инфрачервен лазерен лъч, което води до химически предавана "еквивалентна сила". За да анализираме деформацията или огъването на аксон поради силата в неговия връх (конус на растеж), ние моделирахме аксона като лъч с правилно и равномерно напречно сечение, направен от линеен еластичен материал (микротубули с известна твърдост от 48 завоя ). ), който е хомогенен и изотропен с натоварване, концентрирано в аксоналния терминал. Методологиите, използвани за количествено определяне на тези отклонения, по принцип могат да бъдат категоризирани в аналитични или аналитични методи. Аналитичният метод се основава на теорията на Euler-Bernoulli (EB), която осигурява средство за количествено определяне на такива отклонения. След това се използва методът с крайни елементи, за да се получи решението на радиуса на огъване на кривината на аксоналния вал при постоянна сила върху върха. Подробности, описани в допълнителните методи.