елементи

абстрактно

Основната задача при проектирането на профилактични ваксини срещу рак е да се дефинират имуногенни и безопасни антигени за рак. Поради силното сходство на моделите на експресия на антигени между рака и ембрионалните тъкани, ние дефинирахме прототипна стратегия, използваща протеин от топлинен шок gp96, получен от плацента, който индуцира профилактични отговори на Т-клетки срещу тумори. Имунизацията с плацентарен gp96 осигурява частична защита и дългосрочен (най-малко 3 месеца) антитуморен имунитет срещу растежа на трансплантируем меланом или тумори на гърдата при мишки, предизвиквайки пълна защита срещу 7,12-диметилбенз (а) -антрацен (DMBA) . индуцирани тумори на гърдата при плъхове и значително намалява честотата и растежа на автохтонни тумори на гърдата при HER2 трансгенни мишки. Плацентарни gp96 активираха HER2 и MUC1-специфични Т-клетъчни отговори чрез свързване с тумор-свързани антигени. Нашите резултати показват новата имуногенност на плацентарния gp96 и потенциалното му използване като многовалентна ракова ваксина.

Въпреки забележителния напредък в разбирането на причините за рака и значителния напредък в лечението на рака през последните години, болестта продължава и честотата на рака се увеличава в световен мащаб 1. За разлика от високоефективните профилактични ваксини срещу инфекциозни заболявания, терапевтичните ваксини срещу рак, които не причиняват неприемливи автоимунни нарушения, не са били толкова ефективни, произвеждайки само допълнителни терапевтични ефекти 2. Най-простото обяснение може да бъде, че използването на терапевтични ваксини за лечение на установени тумори е еквивалентно на неуспешния подход за използване на ваксини срещу хепатит В (HBV) или човешки папиломавирус (HPV) за лечение на хронична HBV или HPV инфекция. Съобщава се за няколко механизма за обръщане, които включват изтичане на тумор и потискане на имунната система, вероятно поради дългосрочно развитие на тумори, поява и растеж, включително нарушен отговор на Т-клетките, имунна толерантност и супресивна туморна микросреда, която е вероятно да действа . синергично 3. Това подчертава необходимостта от разработване на профилактичен подход към ваксините срещу рак, който ще осигури евтина и високоефективна рационализация.

Основно предизвикателство при проектирането на профилактични ракови ваксини е да се определят имуногенни и безопасни антигени на рака, които могат да служат като мишени за ефективни ваксини, включително тумор-специфични антигени и протеини, свръхекспресирани върху тумор, но не и върху нормални тъкани. Към днешна дата само ограничен брой ракови антигени са идентифицирани с няколко успеха 4, 5, 6. Добре е документирано, че повечето видове солидни тумори експресират ембрионални антигени в различна степен и има силно сходство в експресията на антиген между рака и ембрионалните тъкани, което осигурява потенциал за насочване на ембрионални компоненти като ефективна стратегия за предотвратяване на рак 7. Ваксинирането с ембрионални или стволови клетъчни антигени води до силен защитен имунен отговор срещу рак 8, 9, 10. Като временен орган, който обменя хранителни вещества и отпадъчни продукти между майката и плода, плацентата също така показва по-висока експресия на свързан с рака ген, включително IGF2, HIF-2a, GPC3, свързания с бременността плазмен протеин A (PAPP-A) и MUC1 11. .

Като член на семейството на протеина на топлинен шок (HSP) от 90, gp96 има уникалната способност да се свързва с антигенни пептиди, да представя тези натоварени антигени към молекулите от клас I и клас II на MHC и да активира специфични Т клетки 12, 13. Нашите предишни проучвания показват, че при рак на черния дроб, заразен с вируса на хепатит В (HBV), gp96 свързва пептидите, получени от вирус, и активира специфични CTL отговори чрез представяне на антиген 14, 15. В допълнение, последните проучвания предоставят убедителни доказателства за gp96 активиране на макрофаги и дендритни клетки чрез взаимодействие с подмножество на Toll-подобни рецептори (TLR) или CD91 16, 17, 18, 19. Клинични проучвания, използващи автоложни gp96-пептидни комплекси като терапевтични ваксини са започнати за лечение на редица тумори с леки противотуморни ефекти 20. Въз основа на горните наблюдения, целта на това проучване е да се определи дали gp96, получен от плацента (P-gp96), индуцира профилактични T-клетъчни противотуморни отговори.

резултатът

Първо тествахме способността на получената от плацента gp96 ваксина да предотвратява тумори, използвайки тестове за предизвикване на тумор. Gp96 протеинът се екстрахира от плацентата или чернодробните тъкани на мишки C57BL/6, както е описано по-горе 21. Мишките C57BL/6 бяха имунизирани подкожно три пъти с gp96, получено от плацента (P-gp96), gp96, получено от черния дроб (L-gp96) или PBS (без имунизация) като контрола. Една седмица след последната имунизация, мишките бяха стимулирани подкожно с B16-F10 меланомни клетки (5 х 104 клетки/мишка). В сравнение с L-gp96 или PBS, имунизацията с P-gp96 значително инхибира растежа на тумора, намалявайки обема на тумора с приблизително 49 или 45% на ден 30 (и двете P

получени

Освен това тествахме дали имунизацията с P-gp96 може да осигури дългосрочен защитен противотуморен имунитет. Мишките C57BL/6 бяха ваксинирани три пъти с P-gp96 или L-gp96, получени от мишки C57BL/6. Три месеца след последната имунизация, мишките бяха инокулирани подкожно с B16-F10 (5 х 104 клетки/мишка). В сравнение с липса на лечение, растежът на тумора се забавя при мишки, лекувани с P-gp96, но не и с L-gp96 (P-gp96).

Женски мишки C57BL/6 (a - d) или BALB/c (e - h) бяха имунизирани три пъти с P-gp96, L-gp96 или PBS. Три месеца след третата имунизация, на мишките се прилагат 5 x 10 4 B16-F10 клетки или 6 x 105 TUBO клетки подкожно. (а, д) Туморното натоварване се измерва на интервали от 2 дни. (b, f) Диаграма на Каплан-Майер за оцеляване на мишки след различни ваксинации. (c, g) Спленоцитите от имунизирани мишки бяха стимулирани с B16-F10 (c) или TUBO (g) антигени на целоклетъчен лизат или BSA за фонова оценка и анализирани от IFN-y ELISPOT. (d, h) Спленоцитите бяха стимулирани с облъчени клетки B16-F10 (d) или TUBO (h) in vitro в продължение на 3 дни и анализирани за цитотоксична активност чрез FACS, използващи маркирани с CFSE клетки B16-F10 или TUBO клетки като целеви клетки. Лентите за грешки показват sd ** P

дискусия

Нашето проучване показа, че gp96, изолиран от плацентата, инициира тумор-специфични Т-клетъчни отговори чрез асоцииране с ембрионални антигени на рака, а gp96 имунизацията осигурява профилактика срещу туморни ксенотрансплантати, както и карциноген-индуцирани или спонтанни ракови заболявания. Като се има предвид антигенното сходство между рака и ембрионалните тъкани 7 и способността на gp96 да свързва целия пептиден репертоар, генериран в клетка 13, нашите резултати следователно осигуряват рационална основа за разработването на многовалентна профилактична ваксина срещу рак.

методи

Човешки проби

Нормални чернодробни тъкани са получени от неизползвани части от пет чернодробни черни дроба, използвани за чернодробна трансплантация в болница You'an в Пекин, Централен университет по медицински науки. Взети са проби от плацента от пет жени, хоспитализирани в Третата болница на университета в Пекин от юли 2011 г. до декември 2011 г. Писмено информирано съгласие е предоставено от всички участници в проучването. Протоколът за изследване е одобрен от Комитета по етика на болницата Пекин You'an и Комитета по етика на Третата болница в Пекин.

Клетъчни линии

TUBO е клонирана клетъчна линия, генерирана от спонтанен тумор на млечната жлеза от мишка BALB-neuT и силно експресира HER-2 протеина върху клетъчната мембрана. TUBO клетки се култивират в DMEM среда (GIBCO), съдържаща 10% фетален телешки серум (FBS), 25 ug/ml стрептомицин и 100 IU/ml пеницилин. Клетките B16-F10 се култивират в среда RPMI 1640 (GIBCO), допълнена с 10% FBS, 25 ug/ml стрептомицин и 100 IU/ml пеницилин.

Мишки и плъхове

Женски мишки BALB/c (на възраст 6-8 седмици) и мишки C57BL/6 (на възраст 6-8 седмици) са закупени от Центъра за изследване на животните в Медицинския отдел на Пекинския университет (Пекин, Китай). FVB/N-Tg (MMTVneu) 202 Mul/J мишки (на възраст от 6 до 7 седмици) бяха любезно предоставени от проф. Mingzhao Zhu (Институт по биофизика, Китайска академия на науките, Пекин, Китай). Женски плъхове Wistar (на възраст 6-7 седмици) са получени от Beijing HFK Bio-technology Co. ООД (Пекин, Китай). Всички експерименти с мишки и плъхове бяха извършени в строго съответствие с правилата на Института по микробиология към Китайската академия на науките на Комитета по етика на изследванията.

Приготвяне на gp96

Мишки, плъхове и човешки P-gp96 и миши L-gp96 се пречистват чрез ConA-Sepharose афинитетна хроматография, последвана от анионообменна хроматография от мишки, плъхове и човешки плаценти или чернодробни тъкани. .

Ваксинация срещу мишки и плъхове

При профилактични проучвания мишките BALB/c и C57BL/6 бяха имунизирани чрез подкожно инжектиране в корема с 20 μg P-gp96/мишка, 20 μg L-gp96/мишка или PBS само на седмици 1, 2 и 4. Една седмица след третата имунизация, на мишките се прилагат 6 х 105 ТUBO клетки/мишка или 5 х 104 В16-F10 клетки/мишка подкожно. В терапевтични проучвания мишките BALB/c се стимулират подкожно с 6 х 105 TUBO клетки/мишка. На втория ден мишките бяха имунизирани с 20 μg P-gp96/мишка, 20 μg L-gp96/мишка или само PBS три пъти на тридневни интервали. За да се оцени дългосрочният защитен имунитет, мишките BALB/c и C57BL/6 бяха имунизирани чрез подкожно инжектиране в коремните хълбоци с 20 μg P-gp96/мишка, 20 μg L-gp96/мишка или PBS самостоятелно на 1-2 седмици. и 4. Три месеца след третата имунизация, на мишките бяха приложени 6 х 105 TUBO клетки/мишка или 5 х 104 В16-F10 клетки/мишка подкожно. Всяка група съдържа поне 10 мишки. След това размерът на тумора се измерва през ден. Мишките са наблюдавани в продължение на 50 дни, за да оцелеят.

Женски FVB/N-Tg (MMTVneu) 202 Mul/J мишки бяха инокулирани чрез подкожно инжектиране в корема с 25 μg P-gp96/мишка, 25 μg L-gp96/мишка или PBS три пъти на седмици 1, 2 и 4 Появата и растежа на тумора се наблюдават на редовни интервали. Женски плъхове Wistar бяха ваксинирани чрез подкожно инжектиране в корема с 25 μg P-gp96/плъх или PBS три пъти на седмици 1, 2 и 4. Една седмица след последната имунизация, плъховете бяха индуцирани да развият рак на гърдата чрез осигуряване на 20 μg/100 g телесно тегло тегло на DMBA (Sigma) в 1 ml царевично масло с помощта на стомашна сонда. Експериментът е прекратен 21 седмици след излагане на DMBA.

Размерът на тумора се определя чрез измерване на най-малкия диаметър (a) и най-големия диаметър (b) с дебеломер. Обемът на тумора се изчислява по формулата: V = (a2b)/2.

DC подготовка и имунизация

Костният мозък беше отстранен от бедрените кости и пищялите на мишки C57BL/6 или BALB/c чрез изплакване на медуларния канал с PBS. Костният мозък се филтрира през 100 μm найлонов клетъчен филтър, преди еритроцитите да се лизират в 0.83 М NH 4 CL буфер. Клетките бяха ресуспендирани в RPMI 1640, допълнена с 10% фетален телешки серум, 100 U/ml пеницилин, 100 ug/ml стрептомицин, 50 ng/ml рекомбинантен миши GM-CSF (R&D системи) и 20 ng/ml рекомбинантен миши IL-4 ( R&D Systems) в концентрация 1 х 107 клетки/ml и култивирани при 37 ° С. Предшествениците на DC се култивират чрез добавяне на 2 ml среда на всеки два дни. На 7-ия ден DC се събират и стимулират с B16-F10 или TUBO туморни клетъчни лизати в концентрация от 50 μg протеин/ml за 24 часа. Делът на DC в културата е постоянно 90%, както се определя чрез анализ на поточна цитометрия.

Мишките BALB/c и C57BL/6 бяха имунизирани чрез подкожно инжектиране в корема с 20 μg P-gp96/мишка, 1 х 106 DC/мишка или PBS самостоятелно на седмици 1, 2 и 4. трета имунизация, на мишките бяха приложени 6 x 105 TUBO клетки/мишка или 5 x 104 B16-F10 клетки/мишка подкожно.

Адоптивен трансфер на Т-клетки

Спленоцитите бяха изолирани от далаците на P-gp96-имунизирани, L-gp96-имунизирани или неимунизирани (PBS) BALB/c мишки, както е описано. CD3 + Т клетките са обогатени (> 90%) чрез магнитно отделяне на зърна (Miltenyi, Biotec, Германия) от култивирани спленоцити. Пречистените Т клетки (2x107) се инжектират интравенозно в γ-облъчени (500 rad) BALB/c мишки, последвано от подкожно излагане на 6 х 105 TUBO клетки/мишка. Размерът на тумора се измерва на редовни интервали и мишките се наблюдават в продължение на 50 дни за оцеляване.

Колекция от периферни мононуклеарни клетки (PBMC)

PBMCs бяха изолирани от прясно хепаринизирана кръв на пет здрави донори чрез градиентно центрофугиране на Ficoll-Hypaque (GE здраве).

Анализ на ензимно свързано имуносорбентно място (ELISPOT)

Анализи на мишки IFN-y и човешки IFN-y ELISPOT се извършват съгласно протокола, предоставен от производителя (Mabtech, Mariemont, OH). Накратко, изолирани миши спленоцити или човешки РВМС (при посочения брой клетки/съответно пулсирани с различни стимули) бяха добавени към ямката в три екземпляра и инкубирани при 37 ° С в продължение на 18-36 часа. Оцветяващите клетки (SFC) бяха преброени и анализирани с помощта на ELISPOT Reader (Biosys, Германия). Споменатите контролни пептиди бяха използвани като фонов контрол.

Тест за Т-клетъчна цитотоксичност

Цитолизата се определя с 5- (6) -карбокси-флуоресцеин-сукцинимидилов естер (CFSE) и пропидиев йодид (PI) чрез две флуорохромни петна. Като ефекторни клетки се използват миши спленоцити или човешки PBMC. B16-F10, TUBO и MCF-7 клетки бяха използвани като целеви клетки в анализа. Целевите клетки бяха предварително маркирани с CFSE и смесени с ефекторни клетки в различни съотношения в краен обем от 200 μl. След 5 часа инкубация при 37 ° С, мъртвите клетки бяха маркирани с PI. Пробите бяха анализирани чрез флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS) с помощта на софтуера CellQuest (BD Biosciences).

PCR анализ в реално време

имуноцитохимия

Тумори на млечната жлеза на плъхове, фиксирани в 4% буфериран формалин, бяха вградени в парафин с помощта на конвенционална автоматизирана система. Вградените в парафин тъкани (5 μm участъци) се оцветяват с хемотоксилин-еозин.

Статистически анализ

Стойностите са изразени като средни ± SD Разлики в средния обем на тумора, SFC, процента на убиване и относителните нива на експресия на иРНК между третирани с PBS, P-gp96 и L-gp96 мишки са сравнени с t-теста на Student и дисперсионния анализ (ANOVA) и post-hoc сравнение с помощта на теста на Tukey. Разликите между кривите на Каплан-Майер бяха сравнени с логаритмичния тест.

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителна информация

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.