елементи

абстрактно

Кожата е тъкан, изключително обогатена с липиди. Участието на кожните липиди в поддържането на кожата и хомеостазата на цялото тяло е добре документирано 1, 2. В допълнение, липидната дисфункция на кожата е свързана с няколко кожни заболявания като акне, атопичен дерматит и псориазис, като основните 3, 4, 5, 6. Липидите на повърхността на кожата (SSL) идват от смес от липиди, получени от два основни източника на кожни липиди. Себумът, аморфният липиден матрикс, секретиран от мастната жлеза (SG) и епидермалните липиди в роговия слой (SC) представляват основните липидни отделения на повърхността на кожата 7 .

Материали и методи

Химикали, реактиви и референтни съединения

Вземане на проби от рогов слой на човека

Stratum corneum (SC) е взет от три различни места на тялото при 10 кавказки доброволци (8 жени и 2 мъже, средна възраст 37,5 ± 7,6 години) чрез многократно отстраняване на пластир D-Squame ™ (CuDerm Corp., Далас, Тексас, САЩ). Доброволците не показаха признаци на кожно заболяване в нито една от пробите. SC проби са взети от воларната повърхност на предмишницата (ARM) и централната област на челото (HEAD) както при женски, така и при мъжки панели, докато SC са взети от централната област на гръдния кош (ГРЕД) само при жени, поради към космите по тялото, присъстващи при мъжете. Изследването е проведено в съответствие с Декларацията от Хелзинки след одобрение от Централната комисия по етика "Fondazione GB Bietti" с писменото информирано съгласие на всеки доброволец.

приготвяне на пробата

инструментариум

Хроматографският апарат се състои от високоскоростна HPLC резолюция от серия 1200 (Agilent Technologies, Германия), оборудвана с дегазатор, автосамплер и термостат, поставени в отделение за колони от същия производител. За бързо разделяне с HPLC с обратна фаза (RP), Kinetex C8, 50 x 2, 1 mm, 1,7 μm, секция на частици, 100 Security колона с пореста секция с предварително колона SecurityGuard ULTRA Cartridge (Phenomenex, Castel Maggiore, BO, Италия), използвано е максималното работно налягане при 600 bar. SC пробите и автентичните стандарти се елуират с двоичен градиент от (A): 5 mM амониев формиат във вода, съдържаща 20% метанол/изопропанол 95: 5 и (B): метанол/изопропанол 95/5. Подвижните фази се филтрират през 0,45 μm стъклени филтри и непрекъснато се дегазират във вакуум. Програмата за елуиране е както следва: 0 - 6 мин. 60% В, 20 мин. 99% В, 20 - 30 мин. 99% В, 36 мин. 60% В, 36 - 38 мин. 60% В. След 2 минути. при 60% В. Скоростта на потока се поддържа на 0.4 ml/min по време на HPLC процедурата и с течение на времето (2 минути). Колоната беше термостатирана при 60 ° С. Обемът на инжектиране беше 4 μl. Инжекционната игла се промива с подвижната фаза в отвор за измиване в HPLC терминала. Изтичането на елуента е свързано с два различни MS анализатора за откриване и характеризиране.

Източник на електроспрей йони и време за полет MS

Извършени са прецизни измервания на масата и изотопния модел с TOF-MS от серия G6220A (Agilent Technologies, Германия), оборудван с ESI интерфейс, работещ в режим на отрицателни йони. Анализите, елюирани от LC системата, се зареждат в TOF-MS инструмент при хроматография под налягане (виж хроматографските условия). Като атомизиращ и дезолтиращ газ се използва азот. Температурата и дебитът на изсушаващия газ са 350 ° С и 10 l/min. Напрежението на капилярите и конусите бяха 4000 и 60 V. Спектрите на TOF в режим на сканиране бяха получени в режим на отрицателни йони, използвайки TOF при 10 000 масови разделителни способности за сканиране в диапазона m/z от 100 до 1200. MS сканиранията бяха обработени с помощта на софтуера Mass Hunter (версия B.01.03). За да се подобри точното измерване на масата на йонните видове, еталонният разтвор се изпарява в непрекъсната партида в спрей камера. Получените данни бяха преобразувани в масовия център на тежестта, от който беше измерена точната стойност на m/z. Количествените анализи на FFA и CHS се извършват по същия LC-MS метод.

ESI-MS с тройна квадруполна MS

ESD спектрите на тандемна маса (MS/MS) бяха получени с тройна квадрупола от серията G6410A (QqQ) (Agilent Technologies, Германия). Данните бяха получени в режим на положителни йони при единична масова резолюция чрез сканиране на йони между m/z 100 и 1200. MS спектрите бяха осреднени и обработени с помощта на софтуера Mass Hunter. Анализите, елюирани от LC системата, бяха въведени в QqQ инструмент при работен дебит (виж хроматографските условия). Като атомизиращ и изсушаващ газ се използва азот, а настройките на източника са същите като за TOF-MS. За да се идентифицира съединението, бяха проведени експерименти с предварителни йони чрез сканиране на третия квадрупол, докато експериментите с продуктови йони (prodION) бяха извършени чрез сканиране на първия квадрупол. Вторият квадрупол е използван като сблъсъчна клетка и в двата експеримента. Използваната енергия на сблъсъка е 34 V, докато напрежението на фрагментатора (F) е зададено на 140 V.

Обработка на данни

HPLC-MS извличане на данни

Анализ на данни и многовариантна статистика

Идентификация на съединението

Идентичността на съединенията, за които е установено, че са значими в класа на разделяне, открит чрез LC-MS анализи, е потвърдена чрез LC-MS/MS, извършена с QqQ анализатор на маса, използвайки описаните по-горе устройства. Експериментите бяха повторени с хроматографски условия, идентични с тези, описани за първичния анализ. Йоните са насочени към фрагментация (CID) фрагментация, предизвикана от сблъсък в QqQ въз основа на предварително определена точна маса и RT, определени от LC-MS. Сравнението на структурата на предложеното съединение с получените фрагменти потвърди идентичността. Точните данни за масата и разпределението на изотопите за прекурсора и йоните на продукта бяха изследвани и сравнени със спектралните данни на референтните съединения, ако са налични, получени при същите условия за окончателно потвърждение (HMDB, METLIN).

Количествени анализи на свободни мастни киселини и холестерол сулфат чрез LC-MS

За количествена оценка на основните FFA и CHS, 1: 1 серийни разреждания на изходен разтвор, съдържащ pmmol/L автентичен FA C16: 1, FA C18: 1, FA C18: 2 и FA C24: 0 и 10 μmol/L CHS. Стандартните разтвори се анализират чрез LC-MS, описана по-горе. Границата на откриване (LOD) и границата на количествено определяне (LOQ) бяха изчислени въз основа на насоките на IUPAC 43. По-специално, LOD се определя като най-ниската концентрация, която има съотношение сигнал/шум (S/N) 3 пъти по-висока от заготовката. LOQ се определя като най-ниската концентрация, при която започва линейността. Линейността е определена въз основа на коефициента на корелация (R). В допълнение, точността, възпроизводимостта в рамките на деня и през деня и добивът бяха определени чрез инжектиране на разтвор от 50 и 5 μmol/l от стандартните FFA и CHS.

Наличност на данни

Файловете с данни, създадени по време и/или анализирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответния автор при разумна заявка.

резултатът

Тестване на значимостта и анализ на основните компоненти

След подравняване и нормализиране, свойствата бяха филтрирани чрез подбор на обекти, които присъстваха в 100% от пробите от всяка експериментална група, като ARM, ГРЪДА и ГЛАВА. Повече от хиляда (1098) субекта бяха открити в общия брой (100%) проби от SC. Разликите между SC за всичките три групи бяха оценени за отделни метаболити от ANOVA (с p

мастните

(А) Анализ на основните компоненти (PCA) и (Б) Графики за CC на обектите, открити в 100% проби от поне едно състояние сред липидните екстракти на ARM, ГРЪДА и HEAT stratum corneum (SC). В рамките на първите два основни компонента (PC) бяха обяснени 50,77% от общата дисперсия, с 38,93% в първото измерение и допълнителни 11,84% във второто измерение. Графиките CC показват стойностите на P-Cor и P-Cov на обектите, определени като керамиди (розови точки), свободни мастни киселини (зелени точки) и съединения, свързани с холестерол сулфат (червени точки), сред обектите, открити в 100% проби в поне едно условие (черни точки).

Изображение в пълен размер

Сгънете промени и клъстериране

Изображение в пълен размер

Йерархично групиране от 52 субекта, които са рутинно модифицирани при сравняване на ARM към ГРЪД, РАК до HEAD и ARM към HEAD, както е показано на ФИГ. 2. Идентичността на анотирания FFA и холестерол сулфат се потвърждава чрез сравнение със RT и MS/MS спектрите на съответното автентично съединение. Анотациите на керамидите бяха потвърдени след генериране на MS/MS спектри.

Изображение в пълен размер

Профили на разпределение на свободните мастни киселини в SC от предмишницата, гърдите и челото

Количествен анализ на основните свободни мастни киселини в SC и холестерол сулфат чрез LC-MS

За да се определят нивата на CHS и броят на основните характеристики на FFA на липидите на себум и епидермална липидна бариера, като FA C16: 1, FA C18: 1, FA C18: 2 и FA C24: 0, количествен метод, базиран на разделяне RP -HPLC и е установено откриване на MS в режим на отрицателни йони. Линейността, LOD, LOQ и регенеративната форма на матрицата бяха оценени за автентични целеви анализирани стандарти. Методът е оптимизиран за количествено определяне на FA C16: 1, FA C18: 1, FA C18: 2 и FA C24: 0 и CHS в SC от ARM, CHEST и HEAD. FFA и CHS се определят количествено спрямо деутерирани d14-PoA и d7-CHS вътрешни стандарти. Дефинираните условия демонстрираха задоволителна линейност, възпроизводимост, добив, чувствителност и LOQ, както е показано в таблица S4. За да се нормализират резултатите спрямо теглото на пробата SC, количествените количества се разделят на mg проба. Целевите концентрации на FFA, определени количествено в SC, са в съответствие с относителните проценти, наблюдавани за ARM, CHEST и HEAD при нецелевия подход. Тъй като количествените резултати, показани на фиг. 4 като nmol/mg SC, специфични за себума FFA като FA C16: 1 се увеличават в ARM ред

Резултати от количествени оценки на биомаркери за секреция на себум и липиди с бариерна епидермална пропускливост в липидни екстракти от ARM, CHEST и HEAD SC. FFA и CHS се определят количествено чрез LC-MS, докато нивата на холестерол и сквален се оценяват чрез GC-MS. Графиките на кутиите показват концентрацията, изразена като nmol/mg SC в ARM (зелена кутия), РЪКА (оранжева кутия) и HEAD (сива кутия). Обобщението на таблицата на фигурата показва средната концентрация, отбелязана с червен кръст в съответната графика на полето, и значимостта, оценена от ANOVA.

Изображение в пълен размер

Количествен анализ на холестерол и сквален в SC с помощта на GC-MS

За да се потвърдят разликите, наблюдавани в относителните количества на епидермални липиди и мастни липиди според разпределението на SG, съответните биомаркери, а именно холестерол и сквален, са количествено определени от GC-MS върху аликвотни части на същите SC екстракти, анализирани преди това от LC-MS. Количествените резултати се отчитат като nmol холестерол и сквален за mg SC на фиг. 4 заедно с LC-MS количествени анализи на FFA и CHS. ANOVA демонстрира, че нивата на холестерола са значително намалени от райони, бедни на SG до богати на SG. За разлика от това, значително увеличение на концентрацията на сквален се наблюдава, когато HEAD се сравнява с ARM и CHEST места.

дискусия

Мащабната липидомия на кожата показва широки вътрешно-индивидуални вариации на SSL по регионална телесна област при хората36. Челната, фронталната, гръдната и раменната области показват подчертан липиден профил в сравнение с всяко друго място на тялото поради мастния пръстов отпечатък, който е свързан най-вече с по-високи нива на триглицериди и диглицериди 36. Нашите аналитични условия бяха избрани за оптимално откриване на епидермални бариерни липиди, като керамиди и CHS, заедно с FFA. Изобилието от специфични членове на семейството на FFA е отличителен белег на матрицата и себума на SPB. В нашата среда FFA беше най-забележителният подпис на мастните липиди. Нашите резултати бяха в съответствие с наблюдението на драстично различни структурни организации на липидни ламели, получени от корнеоцити от стъпалото и челото, където съдържанието на себум беше открито при ниски (1 µg/cm 2) и високи (200 µg/cm 2) нива, 60 . Рамановата спектроскопия показва, че съдържанието на липиди е увеличено в дермата на богата на SG кожа в сравнение с бедна на SG кожа, демонстрирайки абсорбцията на себумните компоненти от епидермиса и долната тъкан. .

Благодаря

Изследването е проведено като част от основна изследователска програма, финансирана от италианското министерство на здравеопазването.