абстрактно
Характеризирайте и сравнете три инбредни щама, склонни към затлъстяване, AKR/J, DBA/2J и C57BL/6J, с три контролни щама, C3H/HeJ, BALB/cByJ и C57L/J, избрани въз основа на техните нормални хранителни навици и средни стойности тегло. печалба от висококалорични диети.
Методи и процедури:
Тези шест щама бяха изследвани на 5-седмична възраст, докато все още имаха нормално телесно тегло и се поддържаха в продължение на 1 ден или 3 седмици на различни парадигми на хранене с диета с макроелементи. Измервани са измерванията на приема на макронутриенти, телесното тегло и увеличаването на телесните мазнини, циркулиращите хормони и метаболити и хипоталамусния пептид, галанин.
резултатите:
Трите контролни щама избраха балансирана диета с 50% въглехидрати и 15-25% мазнини, когато имаха избор от макроелементи и имаха подобен нормален диапазон на оценка за измерване на телесно тегло, затлъстяване, хормони, инсулин и лептин. и метаболити, глюкоза и триглицериди. В сравнение с тази контролна база, предразположени към затлъстяване щамове с подобен общ калориен прием за контрол са избрали диета със значително по-високо съдържание на мазнини (30-40%) и по-малко въглехидрати (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). установи, че някои щамове, включително AKR/J, DBA/2J и C57BL/6J, са чувствителни към ефектите от насърчаване на затлъстяването с високо съдържание на мазнини/калории, диети и други щамове, особено SWR/J и A/J, са устойчиви до затлъстяване и относително не реагират на тези диети. Третата група мишки не са имали различими характеристики, които са паднали някъде между склонни и устойчиви щамове.
Към днешна дата проучванията обикновено сравняват само два щама, склонни към затлъстяване до устойчиви на затлъстяване, и изследват тези щамове на възраст, когато те вече се различават по телесно тегло. Установено е, че щамът AKR/J, склонен към затлъстяване, най-често в сравнение с щама SWR/J, има по-силно предпочитание към хранителните мазнини, по-голямо телесно тегло и депа, по-високи нива на инсулин при диета с високо съдържание на мазнини и по-висок инсулин. - стимулиран транспорт на глюкоза в мастната тъкан. 2, 8, 9, 10 C57BL/6J мишки, склонни към затлъстяване, обикновено в сравнение с устойчивия на затлъстяване A/J щам, също показват подобен ендокринен фенотип и освен това показват повишена склонност към диабет, 11, 12, 13 заедно с намалена липолиза, индуцирана β-адренергична активност при диета с високо съдържание на мазнини 14 и намалена експресия на разцепени протеини-1 и -2 в кафява мастна тъкан. Налична е малко информация за щама DBA/2J. Директното сравнение между предразположени към затлъстяване щамове показва, че мишките C57BL/6J се различават в някои отношения от мишките AKR/J, с по-ниски нива на инсулин и лептин и по-голяма хипергликемия при диета с високо съдържание на мазнини. 15
Материали и методи
елементи
Шест мъжки инбредни щамове мишки, C3H/HeJ, BALB/cByJ, C57L/J, C57BL/6J, DBA/2J, AKR/J, бяха закупени на 4-седмична възраст от лабораторията Джаксън (Bar Harbor, ME, САЩ). ). Всички мишки бяха настанени индивидуално в клетки от плексиглас, съдържащи легло с о-кочани в напълно акредитирано устройство AAALAC (22 ° C, светлини при 1500 ° C в продължение на 12 часа), съгласно институционално одобрени протоколи, както е посочено в Ръководството за употреба и грижа на NIH . животни. Храната и водата са били налични по желание. Всички мишки се държат в еднодневна ферма за гризачи в продължение на 1 седмица преди началото на експеримента, преминават към специфичния им хранителен режим за 1 ден или 3 седмици и след това се жертват. В началото на експеримента тези 5-седмични щамове на гризачи при гризачи бяха сходни по телесно тегло (18-21 g).
диета
Експериментални процедури
Бяха проведени три експеримента с различни парадигми на хранене, като всеки експеримент изследва шест миши щама, които имат n = 7-8 мишки/щам. В експеримент 1 на мишките беше даден избор между две диети, с високо съдържание на мазнини и високо съдържание на въглехидрати. В експеримент 2 бяха предвидени три диети с мазна диета, съдържаща свинска мас или царевично масло, а експеримент 3 тестваше мишки на една диета с високо съдържание на мазнини с 50% мазнини. Измерванията на приема на храна, разлива и телесното тегло се извършват 3 пъти седмично по време на експеримента. Измерванията на хранителните предпочитания се изчисляват като% от специфичните калории на макроелементи спрямо общите консумирани калории. Всички мишки бяха умъртвени в края на светлинния период (1 до 2 часа преди появата на тъмна светлина) чрез бързо обезглавяване. Тяхната едностранна телесна мазнина от три области (ингвинална, ретроперитонеална и епидидимална), както и мезентериалната мастна подложка, бяха разрязани и претеглени, а теглото на мастните подложки беше записано като сбор от четири отделни мастни подложки. В експерименти 2 и 3 се събира стволова кръв за измерване на хормони и метаболити и мозъците бързо се отстраняват и се подготвят за определяне на паравентрикуларно ядро (PVN).
Измервания на хормони и метаболити
Серумът е анализиран за нива на хормони, лептин и инсулин с помощта на RIA тестови комплекти от Linco Research Inc. (MO, САЩ). Метаболитите, глюкозата и триглицеридите (TG) се измерват с помощта на четец за микроплаки E-Max с помощта на комплекта за реагент на Glucose Trinder или TG Assay Kit (Sigma, St. Louis, MO, USA).
Дисекция на мозъка
Веднага след жертвоприношението мозъкът беше поставен в миши матрикс с вентрална повърхност, обърната нагоре, и бяха направени две 0,5 mm коронални секции със средна оптична хиазма като предна граница. Секциите бяха поставени върху стъклен предмет и с помощта на мозъчен атлас 19 на мишката PVN (брегма -0,58-0,94 mm) беше бързо микроскопски разрязан под микроскоп, използвайки форникса и третата камера като ориентири. Това ядро беше изрязано като обърнат равнобедрен триъгълник, 0,5 mm двустранно спрямо камерата и между форниксовите структури, както е описано. Тези дисекции бяха незабавно замразени в течен азот и съхранявани при -80 ° C до обработка.
радиоимуноанализ
Микродисектираните PVN проби се изхвърлят в 2,0 М оцетна киселина и се измерва подобна на галанин имунореактивност, както е описано в 17, като се използва поликлонален антисерум, генериран при зайци върху синтетичен галанин от плъх и 125 I-белязан галанин от плъх (Peninsula Laboratories). Пробите се разтварят в буфер за анализ и първичното антитяло се разрежда в буфер, съдържащ нормален заешки серум (крайна концентрация 1: 75 000 и 0,5%). За настройка се добавят буфери, антитела, проби или синтетични стандарти за галанинов плъх и се инкубират в продължение на 72 часа при 4 ° С. След това се добавя радиомаркиран галанин и инкубацията продължава в продължение на 24 часа. Разделянето на фазите беше постигнато чрез добавяне на кози анти-заешки γ глобулин. Този тест има чувствителност от 4 pg, ED50 от 55 pg и коефициенти на вариране в рамките на интра- и интер-теста от 7 и 18%.
Количествена PCR в реално време
Анализ на данни
Приемът на калории е осреднен за 3-седмичния период на изпитване и данните са представени като килокалории/24 часа. Измерванията на телесното тегло и теглото на мазнините бяха записани в последния ден от експеримента. Всички стойности са изразени като средно ± sem. Със стандартния статистически пакет (SPSS) данните се анализират чрез еднопосочен ANOVA и ако са статистически значими при P 
Ендокринните мерки за три контрол (C3H/HeJ, BALB/cByJ, C57L/J) и три щама, склонни към затлъстяване (C57BL/6J, DBA/2J, AKR/J) (n = 8/щам) се поддържат в продължение на 3 седмици при 3-диетична макронутриентна парадигма на въглехидрати, протеини и мазнини (експеримент 2). Стойностите представляват средно от група ± sem. Еднопосочният ANOVA разкри значителни разлики в щама (P
Шест инбредни щама (n = 8/щам) се характеризират с нива на галанинов пептид в PVN по парадигмата за хранене с 3 диети (Експеримент 2). Стойностите представляват средната стойност от групата ± sem Три щама, склонни към затлъстяване (C57BL/6J, DBA/2J, AKR/J), имат значително по-високи нива на галанин в сравнение с контролните щамове (C3H/HeJ, BALB/cByJ, C57L/J ) (F (5, 42) = 7, 88, P
Друга разлика в степента на техния отговор в сравнение с контролите също е установена при мишки C57BL/6J в сравнение с други щамове, склонни към затлъстяване. Във всеки от тези три експеримента стойностите за теглото на мастните подложки C57BL/6J са постоянно по-ниски от тези за щамовете AKR/J и DBA/2J. Това потвърждава и разширява предишни проучвания, сравняващи щам C57BL/6J с DBA/2J в един доклад 6 или в AKR/J в друг. 3 Резултати от приема на мазнини C57BL/6J и предпочитания към мазнини (32–34%) също са постоянно по-ниски в сравнение с други щамове, склонни към затлъстяване (36–42%), както и корелацията между приема на мазнини и затлъстяването. Освен това е установена различна характеристика на C57BL/6J при измерването на приема на протеини и предпочитанията (40%), които са значително по-високи в сравнение с всички други щамове (20-30%). По този начин, настоящите резултати показват как щамът C57BL/6J, макар и ясно склонен към затлъстяване с предпочитание към мазнини пред въглехидрати, се различава от щамовете AKR/J и DBA/2J по своя поведенчески профил и следователно евентуално по своите механизми. затлъстяване.
В литературата има ограничена информация за хипоталамусните пептиди и тяхната роля за контролиране на храненето и телесното тегло при затлъстели затлъстели инбредни мишки. Съществуващите проучвания обикновено измерват NPY или предно-задния протеин в ядрото на свода и изследват ефекта на диета с високо съдържание на мазнини в сравнение с диета с ниско съдържание на мазнини върху експресията на тези пептиди. Получените резултати бяха смесени. Като се има предвид, че някои проучвания описват потискащ ефект при мишки C57BL/6J в специфични експериментални парадигми, 26, 27, 28, 29 други разкриват този ефект само при мишки, устойчиви на затлъстяване, но не и при щама C57BL/6J, 30, 31, докато обратният ефект, индуцирано от диети стимулиране на NPY, е описано в DBA/2J мишки. 6 Има само едно проучване, което всъщност е направило директни сравнения между тези различни щамове в техните хипоталамусни пептиди. В този доклад, склонен към затлъстяване щам AKR/J в сравнение с контролните мишки C57L/J е имал значително повишена експресия на стимулиращите храненето орексинови пептиди в перифорничния страничен хипоталамус. 7 Особено важно е, че това повишаване на експресията на орексин е свързано с повишени нива на TG, за които е известно, че стимулират експресията на орексините. 7, 20
заключения
Резултатите от настоящото проучване разкриват стабилни изходни резултати за контролните щамове, C3H/HeJ, BALB/cByJ и C57L/J. В сравнение с тази базова линия, те също така предоставят доказателства за фенотип в предразположените към затлъстяване щамове AKR/J и DBA/2J, характеризиращи се с повишен прием на мазнини, нива на TG и PVN галанин и малко по-различен профил в щама C57BL/6J, показан от повишен прием на протеини и хипергликемия. Тези фенотипове са очевидни в млада възраст, някъде преди 8-седмична възраст. Те се появяват и при липса на хиперфагия и в някои случаи преди значителни промени в телесното тегло. Това предполага, че механизмите, отразени от тези различия, могат да имат причинно-следствена роля в диференциалното натрупване на телесни мазнини, проявявано от тези щамове. По-нататъшни проучвания на тези самородни мишки по отношение на контролите, дори в по-млада възраст, могат да бъдат полезни за разкриване на фини смущения, които са критични за диференциалните им склонности към затлъстяване. Такива проучвания трябва да включват измервания на други пептидни системи, освен галанин, които вероятно ще допринесат за повишена склонност към затлъстяване.
Благодаря
Благодарни сме на г-жа Олга Каратаев, Кейт Сепиашвили и Патриша Пами за помощта при подготовката на този ръкопис. Това изследване беше подкрепено от грант USPHS, MH43422.