макроскопски

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • Пациенти и методи
  • Биологично вземане на проби
  • Диагностични критерии за CD и ITB
  • Подготовка на пробата за маркиране на iTRAQ и силна катионообменна хроматография
  • Идентифициране и количествено определяне на протеини
  • Биоинформатичен анализ
  • имунохистохимия
  • резултатът
  • Протеомични експерименти
  • Диференциална експресия на протеин в макроскопски засегната лигавица на дебелото черво на пациенти с ITB в сравнение с контролните биопсии
  • Диференциална експресия на протеин в макроскопски засегната лигавица на дебелото черво на пациенти с CD в сравнение с контролните биопсии на дебелото черво.
  • Диференциална експресия на протеин в макроскопски засегната лигавица на дебелото черво на пациенти с CD и ITB
  • Биоинформатичен анализ
  • Валидиране на диференциално експресирани протеини чрез имунохистохимия
  • дискусия
  • Повече информация
  • Коментари

елементи

  • болест на Крон
  • Язвен колит

абстрактно

Поради последните разработки в клиничната протеомика, ние използвахме тази техника за идентифициране на биологични маркери, които могат да разграничат ITB от CD. Протеомиката е обещаваща технология и се използва за разбиране на биологичните процеси, причинени от възпалително заболяване на червата (IBD) 15. Тъй като и ITB, и CD са първите, които се появяват върху чревната лигавица, сравнението на лигавичния протеом на двете заболявания може да помогне за идентифицирането на диференцирано експресирани протеини, техните потенциални мрежи и взаимодействията, свързани с развитието на двете заболявания. Протеомичният подход вече се използва за откриване на разлики между различните форми на колоиди и за изследване на биомаркера на активността на болестта 16, 17, 18, 19, 20. Протеомиката се използва и в областта на изследванията на туберкулозата при търсене на биомаркери 21. Тази технология все още не е проучена за идентифициране на потенциално полезни маркери, които могат да помогнат да се разграничи ITB от CD.

В това проучване анализирахме и сравнихме протеома на възпалителната лигавица на пациенти с ITB и CD. За сравнение на протеома на двете условия за идентифициране на потенциални биомаркери за диференциацията на двете заболявания е използвана изобарна технология за маркиране за относително и абсолютно количествено определяне (iTRAQ), последвана от двумерна течна хроматография и тандемна мас спектрометрия.

Пациенти и методи

Пациенти с CD и ITB бяха приети от Индийския институт по медицински науки, клиника по гастроентерология в Ню Делхи. Това проучване беше одобрено от Комитета по етика на нашата институция. Изследването е проведено в съответствие с насоките на Индийския съвет за медицински изследвания/добра клинична практика. Информирано и писмено съгласие беше получено от всеки участник в това проучване.

Извършена е пълна оценка на пациентите, включително техните клинични, ендоскопски, рентгенологични и хистологични характеристики. Подробности за приемането на лечение на туберкулоза в миналото са документирани. След подготовката на дебелото черво (полиетилен гликол), всички пациенти са подложени на колоноскопия (и вероятно също ретрограден илеоскопски) преглед с помощта на видео колоноскоп. Докато бяха приети до 30 пациенти и тяхната биопсия беше поддържана при -80 ° C, само тези пациенти, чието проследяване беше завършено и диагнозата ITB или CD беше потвърдена за протеомичен изследователски анализ. Тъй като това проучване беше пилотно проучвателно проучване, ние включихме 15 пациенти във фазата на проучване и 52 пациенти във фазата на валидиране.

Биологично вземане на проби

По време на колоноскопия е документирано сегментно участие на дебелото черво. Получени са няколко биопсии на лигавицата, включително пет до шест парчета от макроскопски анормална област (улцерация, нодуларност) и две до три парчета от биопсия от ендоскопски нормално изглеждащи области. Четирите парчета за биопсия бяха фиксирани отделно в 10% буфериран формалин за хистологични признаци. След адекватно фиксиране парафиновите блокове бяха обработени. От всеки блок бяха подготвени 20 стъпкови участъка с дебелина 4 μm за подробна морфологична оценка. Секции бяха оцветени с хематоксилин и еозин и изследвани от двама патолози със специален интерес към стомашно-чревната патология, които бяха заслепени от клиничните данни и окончателните диагнози на пациентите. За протеомично проучване бяха получени 6-8 биопсии на лигавицата от най-засегнатата област на дебелото черво, най-вече от дясната страна на дебелото черво и илеоцекалната клапа. Биопсии от нормалната лигавица на дебелото черво също са взети от пациенти с ITB като контроли. Тези биопсии се замразяват бързо в течен азот и се съхраняват при -80 ° C.

Диагностични критерии за CD и ITB

Диагнозата на CD е поставена въз основа на насоки на Европейската организация за болест на Crohn и колит, която представлява комбинация от клинични, ендоскопски и хистологични характеристики 22. Диагнозата ITB е поставена въз основа на характерни клинични признаци (коремна болка, запек и/или диария, конститутивни симптоми и чревна непроходимост), ендоскопски признаци (илеоцекално участие, улцерация, нодуларност и стесняване), хистологични признаци (наличие на грануломи), микроби), микроби), (наличие на киселинно-устойчиви бацили за изследване на покритие или демонстрация на киселинно-устойчиви бацили чрез полимеразна верижна реакция) и отговор на антитуберкулозно лечение (паустовски критерии с модификация на Логан) 23, 24 .

Подготовка на пробата за маркиране на iTRAQ и силна катионообменна хроматография

Маса в пълен размер

Катионообменната хроматография се извършва с помощта на система за течна хроматография (Shimadzu, Киото, Япония). Пептидната смес се разрежда с 1 ml буфер А (10 mM калиев фосфат, 25% ацетонитрил, рН 2,9) и се нанася върху катионна колона 2,1 mm x 150 mm, съдържаща 5 μm частици и размер на порите 300 μm (ZORBAX SCX 300; Agilent) Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Пептидите се елуират при 300 μl/минута с градиент от 0% буфер В (1 М KCl, 10 тМ калиев фосфат, 25% ацетонитрил, рН 2.9) в продължение на 10 минути, 0 до 30% буфер В за 25 минути, 30 - 60 % буфер В за 10 минути, 60 - 100% буфер В за 5 минути. След това системата се поддържа в 100% буфер В за 10 минути преди уравновесяване с 0% буфер В за 30 минути преди следващото инжектиране. Тридесет фракции се събираха всяка минута. Мониторингът на елуирането се свързва чрез измерване на абсорбцията при 220 nm и се суши под вакуум.

Идентифициране и количествено определяне на протеини

Пептидите от всяка катионообменна фракция бяха ресуспендирани в 0,1% мравчена киселина и 3% ацетонитрил и инжектирани в нано-LC система (Tempo ™; Siex, Framingham, MA, USA), снабдена с колона C18-75 μm x 150 mm. (Michrom Bioresources, Inc. САЩ). Пробите се обезсоляват онлайн и се използва градиент от 84 минути с увеличаване на концентрацията на ацетонитрил за отделяне на пептидите. Елуентът се разпръсква върху тандемен масспектрометър (QSTAR XL; Siex, Framingham, MA, USA) и се анализира в режим Information Inpendent Acquisition (IDA) с помощта на софтуер (Analyst QS 1.1; Siex, Framingham, MA, USA). Енергията на сблъсъка е зададена със стойност за прихващане от +4 по-висока от стойността, която обикновено се използва за пептиди, за да се осигури достатъчно фрагментация на пептида и генериране на iTRAQ репортерски групи.

Биоинформатичен анализ

Номерата за достъп на идентифицирани швейцарски протеинови протеини бяха използвани за извличане на анотации на генни онтологии от анализ на протеини, използвайки системата за класификация Evolution Evolution (PANTHER). След това се извърши анализ на белтъчната функция и анализ на субклетъчната локализация, като се използва информация за генната онтология, а графиките бяха генерирани с помощта на класификационната система PANTHER (//pantherdb.org; версия 9.0). Базата данни PANTHER беше идеална за функционален анализ с висока производителност на набори от данни от идентифицирани протеинови последователности.

имунохистохимия

Секции бяха изрязани от архивни парафинови блокове на биопсия на дебелото черво, обезпарафинирани и рехидратирани. След това ендогенната пероксидазна активност се блокира с 3% водороден пероксид (H202) и 0,1% протеаза, смилани в продължение на 2 минути при стайна температура. След това секциите бяха инкубирани с първични антитела (Abcam, Великобритания) и инкубирани през нощта при 4 ° С. Първични антитела срещу трилистник фактор-3 (TFF3; 1: 200), тиоредоксин (TRX; 1: 500), трансгелин (SM22; 1: 200), тропомиозин (TPM; 1:50), IgGFc-свързващ протеин (FCGBP; 1): 200) и миозин (MYH; 1: 100) са използвани за потвърждаване на резултатите от протеомния анализ, тъй като е установено, че тези протеини са са диференцирано изразени в възпалената лигавица на пациенти с CD и ITB.

След това предметните стъкла се измиват три пъти с буфериран с Tris физиологичен разтвор (рН 7,6) и накрая се инкубират в продължение на 30 минути с универсално вторично антитяло (BioCare Universal Kit, MACH4, Concord, СА, САЩ). Реакцията антиген-антитяло се визуализира чрез реакция пероксидаза-субстрат, използвайки 3,3'-диаминобензидин (DAB) като хромоген. По време на интерпретацията, полуколичествената оценка се извършва, като се вземе предвид общата площ на експресията на оцветяването и интензивността на оцветяването. Степента на оцветяване с протеини е оценена от 1 до 4, а интензивността на оцветяване е оценена от 1 до 3. Резултатите след това се умножават заедно и крайният резултат се класифицира, както следва: 1 до 3, слабо оцветяване; 4 - 8, леко оцветяване; и 9 - 12, силно оцветяване. Точният анализ на Fisher беше извършен, за да се оцени разпределението на резултата за имунохимична експресия на протеин.

резултатът

Протеомични експерименти

Стратегията, използвана за протеомичен анализ в това проучване, е показана на Фигура 1. Използвани са проби от колоректална биопсия от 15 пациенти (5 с ITB, CD и контроли) според модела, показан в Таблица 1. Общо 533 протеина са идентифицирани в пет извършени експерименти и 241 протеина сред тях са количествено определени, като критериите за най-малко два пептида са количествено определени в талисмана. Сто тридесет и осем протеина бяха идентифицирани и количествено определени в поне два комплекта експерименти (Таблица 2). Резултатите от петте експериментални групи са сравними по отношение на общия брой идентифицирани и количествено определени протеини, а честотата на фалшивите положителни резултати е постоянно ниска. Все още е установено, че хемоглобинът е често срещан. Биоинформатичният анализ на всички идентифицирани протеини беше извършен в PANTHER. Подробен генно онтологичен анализ на тези протеини е показан на ФИГ.

Блок-схемата илюстрира стъпките, включени в набори от 1 до 5 от iTRAQ анализа.

Изображение в пълен размер

Маса в пълен размер

( A ) Кръгова диаграма, показваща разпределението на генетичната онтологична анотация на всички протеини, идентифицирани в макроскопски засегнатата биопсия на лигавицата на дебелото черво при протеомен анализ. Протеините са групирани според тяхната молекулна функция. ( Б) Кръгова диаграма, показваща разпределението на анотацията на генната онтология на всички протеини, идентифицирани в макроскопски засегнатата лигавица на дебелото черво при протеомен анализ. Протеините се групират според известните биологични процеси, в които участват. ( ° С ). Кръгова диаграма, показваща разпределението на анотацията на генната онтология на всички протеини, идентифицирани в макроскопски засегнатата лигавица на дебелото черво при протеомен анализ. Протеините се групират според клетъчното разпределение.

Изображение в пълен размер

Диференциална експресия на протеин в макроскопски засегната лигавица на дебелото черво на пациенти с ITB в сравнение с контролните биопсии

Петдесет и един протеина бяха диференцирано експресирани в биопсии от пациенти с ITB по отношение на контролите с критерии за съотношение iTRAQ 1.3, в поне една поредица от експерименти с iTRAQ. Двадесет и три протеина бяха недостатъчно експресирани в ITB и 28 протеини бяха свръхекспресирани по отношение на контролите. Сред тези протеини, които бяха идентифицирани в повече от един експеримент, четири протеина (миозин-11, инхибиторен фактор на миграция на макрофаги, хетерогенен ядрен рибонуклеопротеин А1 подобен на 2 и миозин-10) бяха значително недоекспресирани (р-стойност).

( A ) Протеини с недостатъчна експресия при пациенти с CD в сравнение с ITB протеини. ( Б. ) Протеини свръхекспресирани при пациенти с CD в сравнение с ITB протеини.

Изображение в пълен размер

Биоинформатичен анализ

Биоинформатичен анализ на свръхекспресирани и недоекспресирани протеини беше извършен в PANTHER. Молекулярната функция, биологичният процес и клетъчното местоположение на тези протеини са подобни на общия покрит протеин. Анализът на пътя на тези диференцирано експресирани протеини се извършва в PANTHER. Различните пътища, с които тези различно експресирани протеини вероятно са включени, са показани на Фигура 4. Подепресивните протеини са анотирани за метаболизма на фруктоза галактоза, сигнален път за апоптоза, каскада, активираща плазминоген, болест на Паркинсон, рецептор за освобождаване на хормона на гонадотропин, гликолиза. и пътища за съсирване на кръвта. От друга страна, свръхекспресираните протеини са анотирани в пътища, включително цитоскелетна регулация, възпаление, интегринов сигнален път, хипоксия, реакция на оксидативен стрес, сигнален път на FAS и сигнален път на G-протеин.

( A ) Кръгова диаграма, показваща анотация на генната онтология и разпределение на пътищата на неекспресирани протеини в макроскопски засегнатата лигавица на пациенти с CD и ITB. (Б) Кръгова диаграма, показваща анотация на генната онтология и разпределение на пътя на свръхекспресираните протеини в макроскопски засегнатата лигавица на пациенти с CD и ITB.

Изображение в пълен размер

Валидиране на диференциално експресирани протеини чрез имунохистохимия

Маса в пълен размер

Фотомикрография, показваща нормалния профил на експресия на трилистник фактор-3 [( A ), IHC [TFF3] x40), IgGFc-свързващ протеин [стрелка] ( Б. ), IHC [FCGBP] x40), миозинова стрелка (( ° С ), IHC [MYH] x40), трансгелин (( д ), IHC [SM22] x40), тропомиозин (( Е. ), IHC [Тропомиозин] x40) и тиоредоксинов протеин [стрелка] ( F ), IHC [TRX] x40). Сравнителни модели на експресия на трилистник фактор-3 при биопсии на дебелото черво:( G ) показва оценка на експресия на фактор 3 на трилистник 12 ((( G ), IHC [TFF3] x40), оценка на израза 6 (( З. ), IHC [TFF3] x40) и резултат на изразяване 0 (( Аз ), IHC [TFF3] x40).

Изображение в пълен размер

дискусия

Това проучване е първият протеомичен анализ на лигавични биопсии от пациенти с CD и ITB и разкри няколко обещаващи кандидати за биомаркери, за да се направи разлика между двете заболявания. В пет серии от експерименти с iTRAQ бяха идентифицирани 533 протеина и бяха определени количествено 241 протеина. Общо 63 пациенти с лигавица на дебелото черво с пациенти с CD и ITB са били диференцирано изразени в поне една поредица от експерименти iTRAQ, от които 11 протеина са били експресирани диференциално в повече от един набор от експерименти. От тях предполагаме, че трилистният фактор 3, синтазата на мастните киселини, миозин 14, миозин 11, човешки тиоредоксин 1, IgG свързващ протеин Fc, трансгелин и тропомиозин, като потенциални кандидати за развитието на биомаркери за разграничаване между CD и ITB.

Протеините, които са били диференцирано изразени в дебелото черво на пациенти с CD и ITB, могат да играят роля в патогенезата на заболяването или могат да се появят в тъканта в резултат на тези заболявания. Например, значително по-ниските нива на трилистник фактор-3 при пациенти с CD вероятно са показател за активност на заболяването. Въпреки че включихме CD и ITB в активната им фаза, различно по-ниската експресия на трилистния пептид-3 при пациенти с CD в сравнение с ITB отразява по-голяма площ на лигавицата при пациенти с CD. В едно от другите ни проучвания наблюдаваме по-високи серумни нива на трилистник фактор-3 при пациенти с излекуван улцерозен колит в сравнение с пациенти с активно заболяване 25. И двете наблюдения предполагат, че трилистният фактор 3 може да бъде добър индикатор за активността на заболяването. Trefoil фактор-3 е един от трите малки, компактни протеина, експресирани от бокалови клетки в стомашно-чревния тракт 26. В допълнение към своите противовъзпалителни свойства, трилистният пептид също играе важна роля за поддържането и възстановяването на стомашно-чревната лигавица. Експресията на трилистника се потиска от фактор на туморна некроза-α, чието ниво остава високо при пациенти с CD27.

Докато дисталният и терминалният илеум участват както в CD, така и в ITB, количеството на лигавицата е по-голямо при пациентите с CD, отколкото при ITB. Четирикратното увеличаване на експресията на синтаза на мастни киселини при пациенти с CD в сравнение с увеличаването на ITB може да се дължи отчасти на по-силно променен метаболизъм на мазнините и ентерохепатална циркулация на жлъчните киселини при пациенти с CD, отколкото при ITB 28, 29, 30 .

В заключение, сравнителният анализ на протеомния профил на биопсии на дебелото черво от макроскопски засегнати области на дебелото черво на пациенти с CD и ITB дава 533 протеина, от които 241 протеина могат да бъдат количествено определени. Протеините се диференцирано експресират в тъканните протеини на пациенти с CD и ITB. Необходими са по-нататъшни експерименти, използващи по-голяма кохорта от хомогенни тъканни проби, за да се намери биомаркер за разграничаване между CD и ITB.

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Rukmangadachar, LA et al. Протеинов анализ на макроскопски засегната лигавица на дебелото черво при болест на Crohn и чревна туберкулоза. Sci. Представител. 6, 23162; doi: 10, 1038/srep23162 (2016).

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или несъвместимо с нашите условия или насоки, означете го като неподходящо.