елементи
абстрактно
Основното
Повечето жени, диагностицирани с рак на яйчниците, които се лекуват по стандартни протоколи, ще умрат от болестта си1 и през последните две десетилетия има минимални подобрения в резултатите. Постигнат е напредък в подобряването на морфологичните критерии за подтипиране на рак на яйчниците, а възпроизводимостта на диагностиката наскоро е увеличена до отлично ниво на възпроизводимост. 5, 5 5 основни подвида на рак на яйчниците (серозен, бистър, ендометриоиден, муцинозен и серозен), които могат да бъдат идентифицирани въз основа на морфологични критерии, се различават в зависимост от генетичните рискови фактори, прекурсорни лезии, молекулярни промени на етапа на представяне и клинично поведение, 3, 5, 6, 7 и най-добре се разглеждат като различни болестни образувания. Поради различията в хемочувствителността между подтиповете на рак на яйчниците, има призив за специфични за подтипа клинични проучвания, за да се идентифицират по-ефективни терапии за тези подтипове (т.е. прозрачни клетки, муцинозни), устойчиви на конвенционалната химиотерапия с платина/таксан. 9, 10, 11
Напоследък е доказано, че неоадювантната химиотерапия, последвана от дебулчираща хирургия, дава подобни резултати като следоперативната химиотерапия при пациенти с напреднал рак на яйчниците с предимството на намалена заболеваемост, съкратено време за операция и по-бързо следоперативно възстановяване. Неоадювантната химиотерапия е ефективна при силно серозни видове рак, но не и при други. Когато неоадювантната химиотерапия се прилага само за определен подтип на рак на яйчниците, това поражда въпроси за това колко надеждно подтипът може да бъде диагностициран на ограничени проби, като проби от ядрена биопсия или биопсия с фина игла. Въпреки че е възможна отлична възпроизводимост, когато диагнозата се основава на изследване на множество предметни стъкла от добре добит тумор, 4 няма доказателства, че подобна възпроизводимост е възможна въз основа на малка туморна проба. Наскоро показахме, че основните подтипове на рак на яйчниците се различават значително в техния профил на експресия на биомаркер 8, което предполага, че експресията на биомаркери може да бъде полезна при диагностицирането на подтипове. Поради това потърсихме най-малкия панел от имунохистохимични биомаркери, които показаха най-висока чувствителност и специфичност за диагностиката на петте основни подтипа на рак на яйчниците.
Материали и методи
Етично изявление
Одобрение за използването на тези групи за това проучване е получено от Изследователския етичен съвет на Агенцията за борба с рака на Британска Колумбия и Университета на Британска Колумбия.
Проучвателни групи и критерии за включване
Това проучване използва три независими кохорти, две за генериране на прогнозни уравнения и една за валидиране на тези прогнозни уравнения (Фигура 1).
Експерименталният дизайн на изследването описва подробно независимото откриване на имунохистохимичен панел от маркери от две несвързани кохорти, точността на прогнозата, представена от статистическата стойност κ (κ) и вътрешната валидация.
Изображение в пълен размер
Първата кохорта, наричана по-долу архивната кохорта, съдържа общо 500 фиксирани с формалин парафинови тъкани на карцинома на яйчниците от предварително описана ретроспективна кохорта въз основа на популацията от Британска Колумбия, диагностицирана между 1984 и 2000 г. Тези проби са от> 20 Британска Колумбия болници., без стандартизация на фиксирането или обработката на проби. Основният критерий за допустимост е диагнозата хемоничен рак на яйчниците, като пациентите са освободени от макроскопско остатъчно заболяване след първична циторедуктивна хирургия, което води до липса на макроскопско остатъчно заболяване. Тази дефиниция на случая доведе до относително голям брой несерозни ракови заболявания в сравнение с очакваното от поредица, включваща всички пациенти с рак на яйчниците. 6
Втората група, наричана по-нататък кохорти от туморни банки, се състои от един набор от болнични случаи на гинекологични тъканни банки в Общата болница във Ванкувър и се състои от 292 проби от пациенти, диагностицирани с рак на яйчниците между 2001 и 2008 г. Тези проби представляват качествена тъкан с кратко време за девитализация и стандартизирано фиксиране и обработка на тъканите.
Третата група, наричана по-нататък кохортата за валидиране, е съставена от прогресивно диагностицирани случаи на рак на яйчниците, наблюдавани в пет центъра в Канада, и включва проби, взети от 2006 до 2009 г., които са били част от скорошно хистоморфологично проучване. 4
Класификация на туморите
Всички хистологични диапозитиви са изследвани патологично (CBG и MK) и са разпределени към един от петте основни подтипа (серозен, бистър, ендометриоиден, муцинозен, серозен, серозен) или други (включително смесени видове рак и редки видове като недиференциран, сквамозен, злокачествен тумор на Бренер, некласифициран) съгласно модифицираните критерии на СЗО, както е описано наскоро. 3, 7 Карциноми с преходен модел на растеж при изследване с ниска мощност, но други характеристики на високостепенния серумен карцином, като цепнатини или микрокистозен модел, са класифицирани като вариант на висококачествен серозен карцином, т.е. серозен карцином (с преходни признаци). Всички случаи, диагностицирани като „други“ (т.е. не един от петте основни подтипа на рак на яйчниците) са изключени от това проучване. Освен това се изисква съгласие между наблюдателите относно диагнозата хистологичен подтип между двамата оценяващи патолози. Случаите на неспазване бяха изключени (N = 98 от 873 случая от три серии случаи (11, 2%)). И накрая, само случаи, когато са налице пълни данни за всички имуностатини, са били подложени на статистически анализ (N = 138 от 775 (17,8%) не са разполагали с пълни данни за всички 22 маркера и са били изключени).
Избор на марка
имунохистохимия
Три тъканни микрочипа са конструирани, както е описано по-горе 13 от представителни туморни области, като се използва тъканна редица (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA и Pathology Devices, Westminster, MD, USA). Две ядра с диаметър 0,6 mm бяха отстранени от всеки донорен блок и прехвърлени в блока на получателя.
Секции с дебелина 4 μm бяха изрязани и оцветени в рамките на 2 седмици след нарязването. Подробности за антителата от окончателния набор от девет маркера и процедури за оцветяване са показани в Таблица 1. Независимо двама патолози (MK или BG) визуално са оценили тези биомаркери от дигитализирани изображения (BLISS скенер, Bacus Laboratories/Olympus America, Lombard, IL, USA ). Всички биомаркери бяха оценени като положителни или отрицателни, като се използва положителна граница на> 1% от клетките (Фигура 2), с изключение на CDKN2A, за която положителното оцветяване беше определено като> 75% от туморните клетки, показващи силно цитоплазматично и ядрено оцветяване като дефинирани. преди това 24 и TP53, където се използваше тристепенна система за точкуване (пълно отсъствие - резултат 0, 1-50% - резултат 1 и> 50% - резултат 2) поради доказателства, че резултати 2 и 0 корелират с изходните мутации, докато резултат 1 корелира с див тип TP53 25 (Фигура 3). По-малко от 5% от случаите показват противоречиви резултати между двата точкуващи патолога и за тези случаи са използвани по-високи резултати.
Маса в пълен размер
Представителни имунооцветители за DKK1, HNF1B, MDM2, PGR, TFF3, VIM, WT1. Прекъсванията между отрицателни (резултат 0) и положителни (резултат 1) са обозначени с дебела вертикална линия.
Изображение в пълен размер
Представителни имуностеини за CDKN2A и TP53. Отрязванията са маркирани с дебела линия. За CDKN2A резултат 0 е отрицателно или слабо положително оцветяване, докато силно положително оцветяване е резултат 1. TP53 се оценява с помощта на система от точки от три части: 0-отрицателна, 1-слаба положителна, 2-положителна. За подробности относно точкуването вижте Материали и методи.
Изображение в пълен размер
Статистически анализ
Готов анализ и статистиката на Pearson 2 (с некоригирани стойности на P) бяха използвани за тестване на хетерогенност на експресията за всеки биомаркер между архивни и туморни кохорти във всеки подтип. Моделирането на реалното лого на регресия с помощта на моделен модел беше използвано за създаване на прогнозни уравнения, които започват на целия панел от 22 маркера. Критерият за изключване на определен маркер се основава на най-високата P-стойност в теста за съотношение на вероятността. За прогнози на модела, характеристичната площ на приемника под кривата (AUC)> 0,95 е определена като желания резултат за всеки хистологичен тип за целите на това проучване.
Валидирането на прогнозните уравнения се извършва чрез прилагане на окончателен имунохистохимичен панел към кохортата за валидиране, за да се създадат прогнозирани хистологични подтипове, които ще бъдат сравнени с консенсуса на хистопатологичния подтип. Подтипът, който моделът счита за най-вероятен, дори ако вероятността е била 27
резултатът
Основни клинични параметри и морфологично оценени подтипове диагнози за архив, туморни банки и файлове за валидиране са изброени в Таблица 2. Поради изискването за интерпретируем резултат на оцветяване за всички 22 имуномаркери, крайните числа за генериране на уравнение за прогнозиране 314 за архивната група и 242 за кохортата на туморната банка. Няма разлика между включените и изключените случаи въз основа на честотата на туморния подтип.
Маса в пълен размер
Както за архивите, така и за кохортите на туморни банки, оригиналният панел от 22 маркера, които са били диференцирано експресирани при подтипове на рак на яйчниците, е бил подложен на пълен модел, постепенно номинална логистична регресия, използвайки обратна елиминация. Критерият за спиране за процеса на обратна елиминация беше да се гарантира, че работната характеристика на приемника под кривата (ROC AUC) е ≥0,95 за всеки подтип.Този итеративен процес предоставя същия панел от девет маркера независимо за кохортите както на архива, така и на тумора банки (Фигура 1). И двете уравнения бяха използвани за прогнозиране на хистологичния подтип в съответните им кохорти, използвайки чувствителността, специфичността, работната характеристика на приемника под кривата (ROC AUC) и коефициента на Коен K (κ). Като цяло уравненията свършиха отлична работа при предвиждането на консенсусни подтипове както за архивни (κ = 0, 88 ± 0, 02), така и за туморни банки (k = 0, 86 ± 0, 04) (Таблици 3 и 4).
Маса в пълен размер
Маса в пълен размер
Точността на нискостепенната прогноза беше тествана чрез прилагане на двете уравнения за прогнозиране към набор от 10 серозни гранични тумори и показа, че уравнението за архивно предсказване класифицира 9 от 10 случая като нискосерийни сероти, един от които е класифициран като висок. - серозен серум, докато уравнението на туморната банка класифицира 1 от 10 случая като нискостероиден серозен карцином, 3 от 10 като серозен серот и 6 от 10 случая като ендометриален. Тези резултати ни накараха да изведем уравнение за предсказване на туморната банка и да създадем ново уравнение за прогнозиране за тази кохорта, базирано само на четири подтипа (серозни, ясни клетки, ендометрид, муцинозни), т.е. да не се опитваме да правим разлика между серозна болест и заболяване на високо ниво . степен серозна. Това имаше малък ефект върху точността на прогнозата за останалите четири подтипа (Таблица 5).
Маса в пълен размер
След това моделите бяха кръстосано валидирани спрямо втората кохорта (Таблица 6). За да определим разликата между уравненията за прогнозиране за архивни и туморни кохорти, извършихме хистологично специфични тестове за хетерогенност за всеки маркер в тестовата и валидационна кохорта. Това показва тенденция към намалена антигенност в архивната група в сравнение с клиничната кохорта и е най-добре илюстрирано, например, чрез честоти на оцветяване с HNF1B в ендометриоидни, прозрачни клетки и муцинозни подтипове (Таблица 7). За разлика от това, PGR при високата степен на серозен подтип показва различни честоти на оцветяване в обратна посока, като 35, 8 и 19,1% от случаите в архивите и групите за туморно банкиране изразяват PGR (P
Графики на логистичната регресия, показващи нарастващ дял на правилните клинични диагнози с повишена вероятност. ( а ) Архивно прогнозиране на архивната кохорта, ( б ) архивни прогнози за кохортата от туморни банки, ( ° С ) прогноза за туморна банка на архивната кохорта, ( д ) прогноза за туморни банки за кохорти от туморни банки, ( д ) прогноза за туморна банка за кохортата за валидиране, ( е ) архивиране на прогнози за кохортата за валидиране.
Изображение в пълен размер
Проучихме профили на прогнози за изключени случаи на недиференциран и некласифициран рак. И двете уравнения за прогнозиране класифицират 9 от 9 случая на недиференциран карцином като високостепенен серозен тип. Пет случая на некласифициран карцином бяха прогнозирани като силно серозни серозни (3) и муцинозни (2), като се използва уравнението за архивно предвиждане и ендометриоидно (2), високостепенно серозно (1) и муцинозно (2) предсказване на туморни банки. уравнение. И четирите случая на серозен карцином с преходни функции (както е дефинирано в раздела Материали и методи) бяха класифицирани като силно серозни сериозно и от двете уравнения за прогнозиране.
дискусия
В това проучване разработихме панел от имуномаркери, които могат точно да предскажат подтип на рак на яйчниците. Този маркерен панел е лесен за прилагане на практика, като осигурява обективна молекулярна подкрепа за класификацията на рака на яйчниците, като по този начин засилва традиционната хистопатологична класификация.
Видовете рак на яйчниците се различават по отношение на прекурсорни лезии, клинично поведение, молекулярни промени и експресия на биомаркери. 7, 8 По отношение на рака на гърдата, където имуномаркерите допринасят за точната диагноза на туморните подтипове и могат да бъдат използвани за насочване на терапевтичното вземане на решения, 28 специфични вида лечение на тумори също са предложени за рак на яйчниците. Например, при жени с диагноза мукозни или ясноклетъчни карциноми, химиотерапията може да бъде неефективна, докато жените с напреднали високостепенни серозни карциноми могат да се възползват от неоадювантна химиотерапия. Интегрирането на молекулярните открития в класификацията на рака на яйчниците има потенциал да увеличи възпроизводимостта и точността на диагнозата, което ще става все по-важно в бъдеще. Например при неоадювантна терапия, която ще се превърне в вариант за лечение на напреднал рак на яйчниците, ще е необходимо точно набиране на основни биопсии или цитологични проби преди лечението.
Силните страни на проучването включват използването на две големи, независими кохорти, едната от които има по-голям дял от подтипове на малцинствата (ясни клетъчни, ендометриални и муцинозни); същите девет маркери бяха получени от 22 кандидат-създатели независимо в тези две кохорти. Използвана е и трета независима кохорта за валидиране, състояща се от случаи, представляващи честотата на подтиповете на практика. 4, 6 Морфологичният "златен стандарт", постигнат чрез подбор на случаи, при които двама специалисти-гинекологични патолози независимо се договарят за подтип диагноза, гарантира, че диагнозите на случаите и в трите серии случаи са последователни и възможно най-точни. Освен това, в стремежа си да осигурим възпроизводимост, ограничихме нашите маркери за кандидатстване за IHC до тези, при които могат да се използват антитела и прости системи за оценка.
Друго ограничение на това проучване е липсата на способността на модела на туморната банка да прави разлика между нискостепенния серозен карцином и високостепенния серозен карцином. Нискокачествените серумни карциноми представляват 3% от рака на яйчниците 6, което затруднява получаването на достатъчно случаи за разработване на модела. Серумните карциноми с нискостепенен серумен карцином произхождат от серозни гранични тумори в много случаи, а не от серозен туберкулозен интраепителиален карцином, не са свързани с зародишни мутации или BRCA1/2 соматични мутации или TP53 мутации, често имат BRAF или KRAS мутации нямат мутации. те също реагират на химиотерапията на основата на платина като силно серозни карциноми. Въпреки че нискостепенните карциноми и високостепенните серотинови карциноми могат да бъдат повторно диагностицирани, когато са налични големи тъканни проби за хистопатологично изследване, разликата между нискостепенния карцином и високостепенния серозен карцином в малки екземпляри е проблематична и е необходима допълнителна работа разработен. биомаркери за подпомагане на тази конкретна диференциална диагноза.
Изображение на уеб калкулатора за подтип на рак на яйчниците (COSP). COSP може да се използва за това, което считахме за „архивен“ или „туморен банк“ материал. Потребителят трябва да определи кое уравнение е най-подходящо за техните проби. COSP може да се използва в единичен режим или като периодичен режим, за да позволи анализ на големи кохорти с ретроспективни тъканни микрочипове с данни, записани в табличен формат.
Изображение в пълен размер
Усъвършенстваното типизиране, което отразява основната биология на тумора и корелира с отговора на терапията, ще помогне за подобряване на клиничното управление при жени с диагноза рак на яйчниците.