eqtl

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Анализ на геномната асоциация на първия отговор
  • Анализ на връзката, която продължава реакция в целия геном
  • Анализ на геномната асоциация на честотата на припадъците
  • Анализ на геномната асоциация на общата латентност, продължителност, честота и вид справяне
  • Репликация във второто стадо хибриди
  • eQTL идентификация
  • дискусия
  • методи
  • Етично изявление
  • Животни, вземане на проби и измерване на свойства
  • Измерване на кортизол
  • SNP генотипиране
  • Цялостна геномна комбинация от поведенческо управление
  • Възпроизвеждане във второ стадо кръстосани прасенца
  • Количествена PCR
  • откриване на eQTL
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • Excel файлове
  • Допълнителна таблица 1
  • Допълнителна таблица 2
  • Допълнителна таблица 3
  • Допълнителна таблица 4
  • Допълнителна таблица 5
  • Допълнителна таблица 6
  • Коментари

елементи

  • Профилиране на генна експресия
  • Регулаторни мрежи

абстрактно

Няколко геномни области и генни варианти, свързани с реакция на стрес, агресия и депресия, са съобщени при хора, както и при животински модели 24, 25, 26. Свинете споделят многобройни физиологични и геномни прилики с хората и следователно осигуряват проследим модел за изучаване на генетичното определяне на поведенчески, физиологични и метаболитни черти 27. Всъщност, поведенческите количествени свойства на локусите (QTL) са картографирани върху стрес 10, диетично поведение 28, поведение на майката 29 и здрави и поведенчески показатели 30 при модели на свине.

резултатът

Общо 294 прасенца от немски Landrace са генотипирани с помощта на BeadChip от Illumina PorcineSNP60, който се състои от 62 163 локуса. След филтриране, 48 909 SNP са използвани за допълнителен анализ. За изследването на асоциирането са използвани най-новите параметри (латентност, продължителност, честота на битките в четири времеви точки) и тип управление на натоварването (високо реактивен (HR), неразличим (IR), ниско реактивен (LR)) . 465 SNP бяха значително свързани с поне една от най-задните черти. Измерихме нивата на кортизол и коефициентите на корелация на управленското поведение, а нивата на кортизол варираха от | 0, 11–0, 20 | и посочи значителна корелация (стр

Черните линии при отрицателен log10 (NegLog10) 5 съответстват на FDR

Черните линии при отрицателен log10 (NegLog10) 5 съответстват на FDR 10-6. Този SNP също беше значително свързан с честотата на припадъците по борба в дни 12 и 19. На ден 12 честотата на борбата с пристъпите беше значително свързана с SNPs между 52 и 56 Mb на SSC12. ALGA0056876 на SSC10 беше най-силно свързан (p 10-6) с Fd12. Етикетите, свързани с Fd19, бяха поставени на SSC12 (53 - 56 Mb), SSC6 (25 Mb) и SSC17 (50 - 56 Mb). SNP (ASGA0055092, ALGA0066975, ALGA0121951), разположени на SSC12, са в рамките на PER1. Също така открихме, че Fd26 е значително свързан с SNP на SSC17 (37 и 64 Mb), SSC1 (22 Mb) и SSC12 (53-56 Mb).

Черните линии при отрицателен log10 (NegLog10) 5 съответстват на FDR 10-5 и FDR

Черните линии при отрицателен log10 (NegLog10) 5 съответстват на FDR

Цветът показва нивото на дисбаланс на връзката между локусите, както е показано в ключа. Блокът LD 4 беше най-големият блок, разположен между 55 и 56 Mb.

Изображение в пълен размер

Десет SNPs бяха свързани с типа управление в FDR 10-7). Останалите пет преписа (RANGRF, PER1, PDZRN3, SH2D4B и LONP2) съдържат trans eQTL (средно р = 1,2 х 10-6). Представянето на cis и trans eQTL е показано на Фигура 6. Като цяло, 38 от 465 SNP, които са били значително свързани с 13-те най-ранни белези, също са били значително свързани с нивата на транскрипти CTC1, UBOX5, RAD51B, IL19, CPAMD, ASGR1 и FBXO39. . Интересното е, че всички те са cis eQTL.

Шестте маркера, свързани с всичките 13 символа за обратно тестване, са ASGA0055092, ASGA0105202, H3GA0034753, ALGA0066975, ALGA0121951 и MARC0073387, разположени на SSC12 (55–56 Mb) в CTC1, PER1 и LOC100739126 (ядрено разпределение протеин nudE), т.е. ) с cis eQTL, trans-eQTL или вероятни функции.

Всъщност тези SNPs също са свързани с нивата на транскрипция на CTC1 в хипоталамуса като cis eQTL. CTC1 (компонент 1 на CTS за поддържане на теломери) кодира компонент от комплекса CST, който предпазва теломерите от разграждане. CTC1 полиморфизмите причиняват мозъчна микроангиопатия 39. Възможната роля на CTC1 за поведение остава неясна, въпреки че има индикации за въздействие върху централните и периферните неврони. Установихме, че алелът A на ASGA0105202 в CTC1 е значително по-висок при LR, отколкото при HR; алелът е свързан с по-висока експресия на CTC1 и CTC1 е по-висока при LR, отколкото при HR. Тази последователна триъгълна връзка между генния полиморфизъм, вариацията на фенотипа и генната експресия демонстрира CTC1 като ген, допринасящ за генетична промяна в поведението за справяне.

Всъщност EQTL допълва GWAS с най-важните характеристики не само като сочи към идентични геномни региони, но и към специфични гени в тези региони с висока LD. ExpressionQTL, особено cis eQTL, осигуряват допълнителни доказателства за асоцииране на гени, тъй като тези гени съдържат SNP, които са свързани с най-задните черти, а също и със собственото им ниво на експресия, което от своя страна е свързано с най-задните черти. SNPs, свързани с характеристиката, е по-вероятно да бъдат eQTLs, в съответствие с ролята на регулаторните SNPs във фенотипна вариация. В резултат на това приложението на eQTL информация може да подобри откриването на SNPs, свързани с особеността на сложните фенотипове 38, 40 .

Гените, свързани с бек тестовите черти, са свързани с неврогенезата и невроналната активност. Например, ген, подобен на ядрения фактор на разпределение Е, регулира неврогенезата на развитието и позиционирането на кортикалните неврони 45, 46. Генетичните анализи разкриха връзка между фактор на ядрено разпределение E (NDE1 или NudE) и неговия NDE-подобен 1 (NDEL1 или Nudel) ортолог с психични разстройства 47, 48 .

WRAP53 е разположен на SSC12 (55–56 Mb), който е регионът, свързан с най-задните свойства, и играе важна роля в теломерните функции, засягащи клетъчния цикъл 49, 50. WRAP53 (съдържа WD повторения, антисенс към TP53) има последици за оцеляването на двигателните неврони 51. Той кодира съществен компонент на холоензимния комплекс на теломеразата, участва в изграждането и поддържането на тела на Cajal, суборганизми, посредничащи за модификации на РНК.

Активираните от хиперполяризация канали и цикличните нуклеотидни канали (HCN) са кодирани от четири гена (HCN1-4) и са широко експресирани в сърцето и централната нервна система. HCN1 е преобладаващата изоформа, за която е известно, че се експресира в хипокампуса, неокортекса и кората 52. HCN каналите участват в възбуждането и синаптичната активност на невроните в отделни неврони и невронни мрежи 53. Съобщава се, че каналите на HCN1 ограничават обучението и паметта и участват в много заболявания, като епилепсия, болест на Алцхаймер и периферна невралгия 54, 55, 56. По същия начин, Liprin-α протеините са основните протеинови компоненти на синапсите и допринасят за синаптичното предаване в различни региони на мозъка 57, 58. Съобщава се, че липрин-нокдаун води до дефект в пресинаптичното развитие и функция 59. И двете SNN в HCN и Liprin са свързани със стила на управление в това проучване, но не и с техните нива на транскрипция.

Други гени, носещи cis eQTL, като UBOX5 и FBXO39, кодират U кутията и F кутионовите протеини и действат като убиквитин белтъчни лигази 60, 61 Членовете на семейство RAD51 функционират както в митотична, така и в мейотична хомоложна рекомбинация и възстановяване на ДНК. Доказано е, че RAD51B е свързан с рак на гърдата и синдром на Вернер, който се характеризира с прогресивна невродегенерация 62, 63. SNPs, открити в тези 3 гена, са свързани с поведенческо управление, а също и с нивото на техните транскрипти като cis eQTL.

Друга област на интерес е SSC3 (139, 8–139, 9 Mb), с 3 SNP (ALGA0107834/ASGR1, ALGA0066945 и ALGA0066946), свързани с 8 до 13 най-ранни знака. ASGR1 нивата на препис също са свързани с ALGA0066945 и ALGA0066946. ASGR1 кодира субединица на азиалогликопротеиновия рецептор и медиира поемането и ендоцитозата на галактоза (Gal) и N-ацетилгалактозамин (GalNAc) крайни гликопротеини. ASGR1 е силно експресиран в хепатоцити 64 и много по-слаб в други тъкани, включително щитовидната жлеза 65 и моноцитите на периферната кръв 66. Азиагликопротеиновите рецептори участват в транспорта на тиреоглобулин и осигуряват връзки с хормоните на щитовидната жлеза с поведенчески последици 67. Установихме, че ASGR1 се експресира в хипоталамуса и демонстрирахме, че неговите нива на транскрипт са свързани с SNP маркери, които също са свързани със стила на управление на свине.

Наскоро се предполага, че дисбалансите на имунната система играят важна роля за психически стрес и поведение 37, 68. SNPs, открити в гените CPAMD8 и IL9, които са свързани с имунната функция, са свързани с управлението и нивото на транскрипция (cis eQTL) в това проучване. CPAMD8 е член на семейството на комплемента 3/алфа (2) -макроглобулин (С3/алфа (2) М) и има вродени имунни функции 69. Доказано е, че психологическият стрес увеличава производството на имуносупресивни цитокини, включително IL19, чрез активиране на бета-адренорецептори, които могат да повлияят на свързаните със стреса болестни процеси 68. Напоследък е доказано, че предполагаемият циплодействащ хаплотип на гена IL19 е свързан с шизофрения 70. Установено е, че SNP, намерени в гените CPAMD8 и IL9, са свързани със стил на управление, което предполага връзка между имунната система и поведението.

Нашите резултати представляват първия анализ на асоциацията, базиран на генома на SNP за поведенчески черти, свързани с вида на справяне. Хипоталамусните гени са идентифицирани в QTL региони, които показват значителен дисбаланс в свързването на eQTL. Най-асоциираните региони са SSC12 (53–56 Mb), носещи cis eQTL сигнали (CTC1 и FBXO39) и транс eQTL сигнали (PER1 и RANGRF). Други cis eQTL сигнали включват ASGR1, разположен на SSC3, IL19 и CPAMD8, разположен на SSC2 и UBOX5 и LOC10051179, разположен на SSC17. SNPs, разположени на HCN1 (SSC16) и Liprin-α (SSC2), които са свързани с невропатологични разстройства, не показват цис или транс eQTL сигнали. Известно е, че гените, идентифицирани в това проучване, участват в сигнализирането на функцията на теломерите, имунната функция, убиквитиновата система, както и циркадния ритъмен път и невротрансмитерните рецептори, т.е. поведенчески невронни проблеми, които осигуряват перспективи за получаване на маркери за предсказване на разплод. По-специално при CTC1 и PER1 с известни физиологични последици за централната нервна система, тяхната роля в поведението е демонстрирана чрез cis-eQTL и потвърдена асоциация в независима популация.

методи

Етично изявление

Всички експерименти бяха проведени в съответствие със съответните разпоредби и насоки. Животните бяха осигурени в Лайбниц институт за биология на селскостопанските животни (FBN). Процедурите за грижа за животните и събиране на тъкани се уреждат от Германския закон за хуманно отношение към животните и експерименталният протокол е одобрен от Института за хуманно отношение към животните към Института по биология на добитъка в Лайбниц и Държавната служба на Мекленбург-Западна Померания (Lebensmittelsicherheit и FALL; TSD/7221, 3-2, 1-020/09). Експерименталният протокол е извършен в съответствие с одобрени насоки за осигуряване на добра научна практика в институциите на Лайбниц.

Животни, вземане на проби и измерване на свойства

Немските прасенца Landrace (DL) (R = 294) са подложени на обратен тест, както е описано по-рано 33. Накратко, многократно проведохме едноминутно ретроспективно проучване на домашни прасенца на 5, 12, 19 и 26-дневна възраст. Животните бяха поставени по гръб в специално устройство с форма на V. Тестът продължи точно 60 s и започна веднага след като прасенцето лежеше неподвижно по гръб. Записани са латентността (L, време до първия мач), продължителността (D, кумулативно време на мача в рамките на 1-минутен период на изпитване) и честотата (F) на атаките по борба. Резултатите от всеки параметър за всяка тествана възраст бяха изчислени, за да отразят сумата от общата латентност (tL), общата продължителност (tD) и общата честота (tF) за всяко отделно прасенце. Прасенцата бяха класифицирани като висока (HR), неясна (IR) или ниска (LR) в реактивност, съгласно следните критерии: HR латентността е ≤ 5 s и LR ≥ 35 s, продължителността на HR е ≥ 25 s, LR ≤ 5 s, и HR честотата е ≥4, а LR ≤ 71 .

Измерване на кортизол

Общата секреция на кортизол се измерва сутрин чрез вземане на 50 ml стволова кръв от всяко прасе по време на кървене на приблизително 180-дневна възраст. Кръвта се събира в пластмасова епруветка, съдържаща 1 ml 0,5 M EDTA, съхранява се върху лед до плазмената изолация и след това се съхранява при -80 ° C за дълги периоди. Общите плазмени нива на кортизол се определят чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (DRG, Marburg, Германия) в два екземпляра съгласно протокола на производителя. Вариантите на вариация между тестовете са ≤ 7,0% и 9,8%, съответно. Коефициентът на корелация на Spearman (Spearman rho, rs) и връзката между нивата на кортизол и поведенческото управление също бяха изчислени.

SNP генотипиране

Генотипизирането се извършва с помощта на PorcineSNP60 BeadChip (Illumina Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ) съгласно протокола SNP Infinium HD на производителя. Накратко, 200 ng ДНК бяха амплифицирани, фрагментирани и хибридизирани до PorcineSNP60 BeadChip, съдържащ 62, 163 специфични за локуса 50-мери. Данните за интензитета бяха измервани и качествените резултати и генотипове бяха извлечени с помощта на софтуера GenomeStudio (Illumina Inc.). Miery hovorov (72, 73. В допълнение, генотипът и полът са използвани като фиксирани ефекти, денят на раждането е използван като случаен ефект, а теглото на прасенцето е използвано като ковариатор. Извършен е и тест за генотип за асоцииране на алели на SNP. правилно за многократно тестване, беше използван процент на фалшиво откриване (FDR) от 5%.

Възпроизвеждане във второ стадо кръстосани прасенца

Общо са използвани 794 кръстосани животни от породите немски ландрас (DL) и едро бяло (DE). Данните са събрани от изследователска ферма на Института по животновъдство и животновъдство към Университета Кил. Тестовете за 1 минута назад са били извършвани многократно на възраст от 12 и 19 дни. Най-значимите SNP в PER1 (ASGA0055092) и CTC1 (ASGA0105202) са използвани за генотипиране чрез пиросеквениране. За анализ на асоциациите са използвани генерализирани линейни смесени модели (Proc Glimmix; JMP Genomics (SAS Institute, Cary, NC, USA)) с матриците на видовете на индивиди, считани за случаен ефект, генотип и пол като фиксирани ефекти. За да се коригира многократното тестване, беше използван процент на фалшиво откриване (FDR).

Количествена PCR

откриване на eQTL

Експресионните нива на 37 транскрипта от хипоталамуса на 184 индивида, представляващи подмножество от тези, използвани за обратни тестове, са били подложени на дисперсионен анализ със смесен модел, използвайки JMP Genomics (Proc Mixed; SAS Institute, Rockville, MD). Както в GWAS на бектестовите черти, матрицата на IBD между индивидите е използвана като случаен ефект и основните основни компоненти като ковариати, коригирани за стратификация в популацията. В допълнение, генотипът, полът и партидата на RT-PCR бяха използвани като фиксирани ефекти, а теглото при клане и средната средна стойност на стойностите на гена CT за домакинство бяха използвани като ковариати. За да се коригира многократното тестване, беше използван процент на фалшиво откриване (FDR) при 5%. Дефинирахме eQTL като „cis“, ако асоцииран SNP се намира в зона, по-малка от 1 Mb от гена. Всички останали eQTL се считат за „транс“.

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Ponsuksili, S. et al. Интегрираните проучвания за асоцииране на целия геном и хипоталамуса eQTL показват връзка между свързания с циркадния ритъм ген PER1 и поведението за справяне. Sci. Представител. 5, 16264; doi: 10.1038/srep16264 (2015).