елементи
абстрактно
Подкожните и интрамускулните мастни натрупвания са важна характеристика на оценката на готвените говежди продукти. Мраморността, определена като интрамускулно съдържание на мазнини, допринася за мекотата, сочността и вкуса на месото, които са важни за качеството на говеждото месо. По принцип подкожната тъкан има приоритет за запълване с адипоцити, последвана от интрамускулни зони, което води до по-малко мраморна секреция. Намаляването на подкожните мазнини и подобряването на натрупването на интрамускулни липиди в съвременното производство на говеждо месо остава основно предизвикателство 1. Адипогенезата, процесът, чрез който преадипоцитите се диференцират в адипоцити, играе решаваща роля за натрупването на мастна тъкан при животни 2, 3. Точното разбиране на молекулярните механизми на съхранението на телешка мазнина е от съществено значение за производството на висококачествено готвено говеждо месо.
През последните години се използва засилено използване на дълбоко транскриптомно секвениране за идентифициране на диференциално експресирани miRNAs, както и възможността за откриване на нови транскрипти, включително нови алтернативни изоформи и miRNAs 4, 5, 6, 7. С бързото развитие на последователността от следващо поколение (NGS), изследването на miRNAs става все по-постижимо от преди 8, 9, 10, 11. Отлагането на мазнини е сложен биологичен процес, при който miRNAs могат да играят регулаторна роля. В мастната тъкан натрупващите се доказателства ясно показват, че miRNAs играят важна роля в диференциацията на адипоцитите и метаболизма на липидите 12, 13. Установено е, че много miRNAs като let-7 14, miR-143 15, 16, 17, miR-17-5p 18, miR-14 19 и miR-33 20, 21, 22 регулират диференциацията на адипоцитите и липогенезата чрез различни сигнали пътища, включително Wnt, MAPK, регулиране на клетъчния цикъл и инсулинови пътища. Ядрените рецептори като CCAAT/енхансер-свързващи протеини (C/EBP), активиран от пероксизома пролифератор рецептор (PPAR) и стерол елемент, регулиращ свързващите протеини (SREBP) също са важни. Тези открития предполагат, че miRNAs могат да участват в натрупването на говежди липиди в мастната тъкан и мускулите.
Доказано е, че е жизнеспособна стратегия за изследване на механизмите на адипогенезата и натрупването на мастна тъкан чрез сравняване на моделите на експресия на miRNA и/или mRNA между различните породи говеда. Wang et al. 23 сравнява модел на експресия на мускулна мастна тъкан между Wagyu × Hereford и Piedmontese × Hereford хибриди и набор от гени, свързани с адипогенезата и липогенезата, като Adiponectin (ADIPOQ), Stearoyl-CoA desaturase (SCD) и хормона на индуктора на щитовидната жлеза. протеин (THRSP), бяха регулирани нагоре в групата Wagyu × Hereford 23. Друго проучване също сравнява профилите на експресия на miRNA на подкожната мастна тъкан от няколко хибрида в клон 24. Сравнението на чистопородни говеда с различни характеристики за съхранение на мазнини ще предостави нова информация за ролята на различните miRNA.
Говедата Wagyu са известни с високата си мраморност, т.е. с високи нива на интрамускулно натрупване на липиди, докато друга известна ферма за добитък, голщайни говеда, има много по-малко мраморност в сравнение с Wagyu 25, 26. Разликата в съхранението на мазнини между говедата Wagyu и Holstein привлича много внимание при изследване на сравнителния механизъм в областта на адипогенезата и липогенезата на говедата. Предишни изследвания за разликата в съхранението на мазнини между говеда Wagyu и Holstein са се фокусирали главно върху диференциалната експресия на специфични гени като SCD 27 и преадипоцитен фактор 1 (Pref-1) 25. Към днешна дата не е известна разлика в модела на експресия на miRNA между говеждото месо Wagyu и Holstein. В настоящото проучване беше извършен екран с висока пропускателна последователност за сравняване на нивата на експресия на miRNA на подкожната мастна тъкан между Wagya и Holstein. Нашата цел е да идентифицираме възможните miRNA регулатори на натрупването на мастна тъкан и да предоставим нови прозрения за възможните механизми за съхранение на говежди мазнини.
резултатът
Изграждане на малки RNA библиотеки
За да идентифицираме мастни диференциално експресирани miRNAs в обратния растеж между Wagyu (W) и Holstein (H) говеда, ние изградихме W и H малки RNA библиотеки. Използвайки последователността на Illumina, бяха получени общо 12 435 335 и 10 962 269 сурови данни от библиотеки W и H. След нискокачествени последователности, polyA, последователности, по-къси от 18 или по-дълги от 45 nt, и повторни последователности, 10, 974, 628 (88, 32 %) и 9, 417, 372 (85, 96%) чисти показания в библиотеките W и H бяха получени накрая за допълнителен анализ (Таблица 1). Малкото разпределение на дължината на РНК на двете библиотеки показа, че най-разпространените видове са с дължина 21-22 nt, което е типичен диапазон на размера на продуктите, получени от Dicer (Фиг. 1). След това тези почиствания бяха подравнени с базата данни Rfam, за да се филтрират некодиращи РНК като tRNA, rRNA, snoRNA и snRNA. Като цяло, 35, 28% и 33, 46% различни стойности на общите малки РНК в библиотеките W и H са идентифицирани като запазени miRNAs, което показва, че секвенирането в това проучване е успешно (Фиг. 2).
Маса в пълен размер
Изображение в пълен размер
Изображение в пълен размер
След това филтрираните броячи бяха подравнени с говеждия геном и картографираните miRNA последователности бяха избрани така, че BLAST срещу miRBase идентифицираха запазени miRNAs и изчисляваха нивата на тяхната експресия. 208 запазени miRNAs бяха успешно идентифицирани както в W, така и в H библиотеките. В допълнение, 48 miRNAs бяха специфично експресирани в задната част на говедата от Холщайн и 14 miPHK бяха експресирани само при говеда Wagyu (Фиг. 3). Последователностите, които не съвпадат със запазени miRNAs, бяха използвани за потенциално предсказване на нови miRNAs. Анализът на стойностите на транскрипта на милион (TPM) показа, че в библиотеките W и H първите десет miRNA с висок брой представляват 60% от общите miRNA, включително let-7 14, miR-143 15, 16, 17, miR-21-5p 28, miR-27b 29, 30, 31 и miR-378 32, за които се твърди, че преди това са участвали в диференциацията на адипоцитите (Фиг. 4).
Изображение в пълен размер
Изображение в пълен размер
Диференциално експресиран анализ на miRNA между говеда Wagyu и Holstein
В това проучване за секвениране нивото на експресия на miRNA, изразено и в двете библиотеки, се определя количествено чрез TPM, ако TPM с | log2FC | ≥ 1 и p-стойност, коригирана с FDR
Изображение в пълен размер
Анотация на GO и KEGG пътищата на миРНК целеви гени
Анализ на взаимодействието на miRNA-протеин
Мрежата за взаимодействие на miRNA и протеини е конструирана, за да разкрие връзката на предсказаните целеви гени в PPAR сигналния път и miRNAs са направлявани, за да идентифицират потенциални регулатори (фиг. 6). В съответствие с данните, показани на фиг. 5 резултата показват, че PPARα и RXRα играят централна роля в PPAR сигналния път и могат да бъдат цели, регулирани от bta-miR-196b и bta-miR-874.
Изображение в пълен размер
Валидиране на miRNA секвениране чрез qPCR
Нивото на експресия на 4 диференциално експресирани miRNAs е избрано и проверено чрез qRT-PCR (Фиг. 7). В съответствие с данните за последователността на miRNA, резултатите от qRT-PCR от 4 произволно избрани miRNAs показват подобен модел на експресия в двете библиотеки, което допълнително потвърждава, че нашите данни за последователността са надеждни.
Сравнение на относителните стойности на израза ( A ) и TPM ( Б. ) от четири избрани диференциално експресирани miRNAs. ( A ) Относителното ниво на експресия на избрани miRNAs беше измерено чрез количествена PCR в реално време, данните бяха изразени като средна стойност ± SD. **, *** стр. 35. Точната им роля на miRNAs при отлагането на мазнини от говеда далеч не е ясна. В това проучване ние извършихме високопроизводително секвениране на РНК, за да идентифицираме miRNAs, свързани с различни свойства за съхранение на мазнини между говеда Wagyu и Holstein. В това проучване установихме, че нивата на експресия на miR-142-3p, miR-379 и miR-196a са по-високи в мастната тъкан на говедата Wagyu в сравнение с Холщайн (Таблица 2). Изследванията на Chartoumpekis et al. (2012) и Meale et al. (2014) също съобщават, че тези miRNAs регулират липогенезата и съхранението на мазнини при други животни 36, 37. Като цяло, това проучване показва, че по-високите нива на мускулна мазнина при говедата Wagyu могат да бъдат отдадени отчасти на тези 3 силно експресирани miRNAs.
Интересното е, че bta-miR-320a също беше представен в десетте най-богати miRNA и показа значително различен профил на експресия между говеда Wagyu и Holstein (P 38. Семейството MiR-320 насърчава адипогенезата, като блокира диференциацията на други MSC (т.е. остеобласти) Друго проучване също установи, че miR-320 регулира инсулиновата резистентност чрез сигналния път на инсулин-PI3K 39. Заедно с текущия ни резултат, miR-320 играе важна роля в адипогенезата и произтичащата от това разлика в съхранението на мазнини между говедата Wagyu и Holstein.
Освен това установихме, че нивата на експресия на miR-136, miR-190a, miR-411a, miR-708, miR-1940 и miR-2887 са значително по-високи при Wagyu в сравнение с говедата на Холщайн (P 40. Сигнализиращият път Notch е ключов път в клетъчната онтогенеза и диференциация 41. Няколко предишни проучвания посочват ролята на пътя на Notch в диференциацията преди адипоцитите и предполагат, че активирането на сигналния път на Notch може да инхибира диференциацията на адипоцитите 42, 43, 44, 45. В настоящо проучване, 8 miRNAs целеви гени, включително Delta-подобен протеин 1 (DLL1), хомоложен протеинов хомолог DVL-3 (DVL3) с полярност, хистонова ацетилтрансфераза KAT2A (KAT2A), субединица на гама-секретаза PEN-2 (PSENEN), транскрипционен фактор HES-5 (HES5)), хистонова деацетилаза 1 (HDAC1), E3 убиквитин-протеинова лигаза DTX4 (DTX4) и E3 убиквитин-протеинова лигаза DTX2 (DTX2) участват в сигналния път на Notch, което предполага, че някои miRNAs регулират диференциацията на адипоцитите чрез адипоцити пътеката Notch.
заключение
В това проучване използвахме високопроизводителна последователност на малки РНК, за да сравним нивото на backRat miRNAs между говеда Wagyu и Holstein. Доколкото ни е известно, това е първото изследване на miRNA профили на мастна тъкан между говеда Wagyu и Holstein, за да се изследват възможните механизми за съхранение на мазнини. В нашето проучване са идентифицирани няколко miRNAs, които могат да регулират адипогенезата чрез своите цели и свързани пътища. Сред тях, регулираните нагоре bta-miR-196b и регулираните надолу bta-miR-874 могат да повлияят на транслацията на сигнала на PPAR пътя от техните цели, участващи в пътя, и впоследствие да регулират съхранението на мазнини. Нашите резултати предоставят информация за микроРНК, които са били диференцирано експресирани в подкожната мазнина на две различни породи говеда с различни нива на отлагане на мрамор, осигурявайки по-добро разбиране на молекулните механизми на отлагането на мазнини от говеда.
Материали и методи
Експериментални животни и подготовка на проби
Всички експерименти са извършени в съответствие със съответните директиви и регламенти, подадени от Министерството на земеделието на Китайската народна република. Всички експериментални протоколи са одобрени от Института по наука за животните към Китайската академия на земеделските науки, където е извършен експериментът.
В това проучване добитъкът Wagyu и Holstein е предоставен от Пекин Huairou Wagyu Technology CO (Пекин, Китай) и компанията за производство на месо Langfang Xingcheng (Хъбей, Китай). Пет мъжки говеда Wagyu и пет мъжки говеда на възраст от около 30 месеца бяха избрани за събиране на дорзална подкожна мастна тъкан между 12 и 13 ребра. Мастната тъкан се отстранява веднага след убиването на животните и веднага се съхранява в течен азот за по-нататъшна екстракция на РНК.
Изграждане и последователност на малки РНК библиотеки
Общата РНК се извлича от мастна тъкан, използвайки TRIzol (Invitrogen, САЩ), съгласно инструкциите на производителя. Аликвотни части от обща РНК (10 μg) от пет говеда Wagyu или Holstein се смесват в равни количества, за да образуват сборна проба като библиотека W (за говеда Wagyu) и H (за говеда Holstein). Общата концентрация на РНК се измерва със спектрофотометър NanoDrop 2000 (система GE, САЩ) и биоанализатор Agilent 2100 (система GE, САЩ). Малки РНК се изолират с помощта на PEG-8000 (Sigma, САЩ), РНК се лигира с 3 'адаптер и след това се фракционира с размер 15% чрез денатуриране на полиакриламиден гел електрофореза. Получават се фракции от 36 до 44 nt и се свързват с 5'-адаптера. Малките РНК фракции се транскрибират обратно и след това се амплифицират чрез PCR, ампликоните се зареждат върху 3,5% агарозен гел, фракции 140-160 bp се получават като библиотека. Малките РНК библиотеки бяха скринирани с qPCR и концентрацията беше по-голяма от 2 nM, което показва, че библиотеките са надеждни. След това библиотеките W и H бяха секвенирани с помощта на Hiseq-2000.
Биоинформатичен анализ на малки РНК последователности
Суровите четения, получени от библиотеките, първо се обработват със софтуера Cutadapt и инструментариума FASTX, за да се получи чисто четене във файлове FASTQ. Оценката на качеството на данните за последователността, включително базово разпределение, GC съотношение, PCR дублиране и честота на деформация, бяха оценени с помощта на FastQC софтуер. Функцията FASTQ Information в набора от инструменти FASTX е използвана за анализ на разпределението на дължината на РНК последователностите. Чисти малки РНК последователности с дължина между 18 и 45 nt, получени от библиотеки, бяха сравнени с базата данни Rfam (Rfam 10.0), използвайки Rfamscan и Blastn за отстраняване на rRNA, scRNA, snRNA, snoRNA и tRNAs 51. Останалите различни последователности бяха използвани за търсене на miRBase (miRBase19.0), използвайки miRDeep2 за идентифициране на запазени miRNAs 52, 53. За да се предскажат нови кандидати за miRNA, последователностите бяха картографирани в говеждия геном от ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-76/fasta/bos_taurus/dna/ с помощта на bowtie2 и беше изчислена miRDeep2.
Диференциално изразена идентификация на miRNA и прогнозиране на целта
Броят на запазените miRNAs, идентифицирани от miRDeep2 между библиотеките W и H, бяха използвани за анализ на израз 54. За да се оцени значимостта на разликата в експресията на miRNA, за изчисляване на набора от данни за преброяване е използвана програмата "edgeR" 55 за пакет R. Струва си да се отбележи, че се избягват фалшиво положителни резултати, само TPM s | log2FC | ≥ 1 и p-стойност, коригирана на FDR 56 .
Генна онтология (GO) и анотация на Киото енциклопедията на гените и геномите (KEGG) миРНК целеви гени и анализ на взаимодействието miRNA-протеин
Извършен е GO анализ на скринирани целеви гени на miRNA, за да се предвидят потенциални биологични процеси и функции, които най-вероятно ще бъдат засегнати от miRNA, като се използва базата данни за анотации, визуализация и интеграция (DAVID) 57. Най-важните GO категории, биологични функции и различни канонични пътища бяха анализирани за миРНК-специфични цели, както и за всички тествани цели, въз основа на значителна генна свръхекспресия с помощта на теста на Фишър. След това целевите гени на miRNA бяха анотирани в пътя на KEGG, използвайки DAVID 58. Освен това използвахме базата данни String (//string-db.org/), за да предскажем мрежата за взаимодействие на miRNA-mRNA на целевия ген.
qPCR валидиране на идентифицирани miRNAs
Експресионните нива на 3-те диференциално експресирани miRNAs, bta-miR-320a, bta-miR-874 и bta-miR-1247-3p и предсказаната нова miRNA chr4_8522, бяха избрани на случаен принцип и проверени чрез qRT-PCR. Накратко, общата РНК, екстрахирана от задната мазнина на говедата, беше обратно транскрибирана, за да се получи кДНК. След това беше извършена PCR реакция в реално време за измерване на нивата на експресия на miRNA. Всички реакции се провеждат в три екземпляра с реакционен обем 10 μl (5 μl 2 x LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 0,2 μl PCR праймер, 0,2 μl PCR обратен праймер, 1 μl cDNA и 3,6 μl нуклеаза). Н20) и се инкубира (95 ° С за 10 минути, след това 40 цикъла при 95 ° С за 10 секунди, 60 ° С за 30 секунди). Сравнителният Ct метод и вътрешният контролен miRNA ген U6 бяха използвани за изчисляване на относителните нива на експресия на гена. Всички qPCR реакции дават един пик на дисоциационната крива, което показва специфични амплификации.
Статистически анализ
TPM се използва за оценка на нивата на експресия на miRNA и се изчислява съгласно формулата. Във формулата библиотекаряването представлява общия брой на всички идентифицирани miRNAs, а miR_readscounts показва броя на специфичните miRNAs.
При обработката на анализа за обогатяване на целевия ген, хипергеометричното разпределение и точният анализ на Fisher бяха използвани за изчисляване на р-стойности, използвайки формулата по-долу. Във формула а представлява броят на целевите гени в термина GO или път, който трябва да бъде открит, b представлява нецелеви гени, броят на нецелевите гени замества броя на нецелевите гени от същия термин, c представлява броят на целевите гени в последващи срокове, други дати. Тъй като това е многократен тест, р стойностите се коригират по метода на фалшивото откриване (FDR).
Всички данни за qPCR са представени като средно ± SD. Когато бяха направени сравнения, t-тестът на Student беше извършен с помощта на SPSS 17, 0 (IBM, USA) и p