елементи

абстрактно

Основното

Макроавтофагията (наричана по-долу автофагия) е силно запазен катаболен процес и участва в различни клетъчни функции. Това се случва при физиологични условия на базално ниво и играе роля в клетъчната хомеостаза, като разгражда лошо сглобените протеини и увредените органели. Разграждащият се материал се изолира във везикули, известни като автофагозоми, които в крайна сметка се свързват с лизозомите. Автофагията е диференцирано регулирана при стареенето и също така участва в патофизиологичните процеси, включително рак. 1, 2, 3 Каноничната автофагия реагира на стимулите от околната среда чрез различни фактори, които принадлежат предимно на генни хомолози (atg), които първоначално са идентифицирани в дрождите. Двата основни регулатора, регулиращи каноничната автофагия, са целта на бозайниците на рапамициновия комплекс (mTOR) 1 (mTORC1), който негативно регулира автофагичната активност, и комплекса Beclin1/III фосфатидилинозитол 3-киназа (PI3K). Класове, необходими за нуклеация на автофагозомната мембрана. Разширението на мембраната се извършва от две конюгационни системи, подобни на убиквитин (ATG12-ATG5 и ATG8/LC3) и членове на семейството протеини ATG18 WD с 1-3 домейн на взаимодействие с фосфоинозитид (WIPI1-3) (регулирането на автофагията е добре оценено в справка 5 6, 7).

Наскоро обаче бяха открити неканонични автофагични пътища, които се различават от каноничната сигнализация по това, че не изискват непременно йерархичното действие на ATG протеините и протеиновите комплекси. Например, нехалоничните автофагични пътища, независими от комплекса Beclin1 или mTORC1 и ULK1, са известни като 9, 10, 11, 12, но в крайна сметка всички водят до сливане на автофагозоми с лизозоми и разграждане на субстратите в тези киселинни отделения.

В съответствие със сложността на автофагичните пътища, описани досега, има многобройни последици от автофагията в патофизиологичните процеси. Автофагията засяга например ранното образуване на тумори и поддържането на тумора, както и ефективността на терапевтичната намеса. 13, 14, 15, 16 Променена експресия на ATG протеин и променена автофагична активност са показани в различни ракови тъкани, от стволови клетки на глиобластома до ракови клетки на гърдата. Напоследък е доказано, че ко-шаперонът Bcl-2-асоцииран атаноген 3 (BAG3), който модулира свързаната с възрастта автофагична активност, намалява селективността на автофагията чрез селективна аутофагия и е силно изразена в естроген-рецептор-позитивните невробластом и рак на гърдата клетки. 17, 18, 19, 20, 21

В това проучване ние предоставяме доказателства, че ERα задейства неканонична автофагия, независима от свързването на лиганда и неговата ERE-медиирана активност, медиирана от транскрипционен фактор в различни установени ER-експресиращи туморни клетъчни модели и човешка тъкан от рак на гърдата. Ние показахме, че намаляването на автофагичната активност на нокаута на BAG3 и блокирането на лизозомното разграждане сенсибилизира ER α-положителните клетки към стрес. Подробен анализ на автофагичния път, показан тук, може да отвори нови стратегии при лечението на ER-положителни клетки на α-гърдата на гърдата, които не реагират на лечение с AE или инхибитори на ароматазата.

резултатът

Експресията на ER диференцирано регулира транскрипцията на гени, свързани с автофагия

ER са или транскрипционни фактори, които взаимодействат директно с елементи на естрогенния отговор (ERE) и чрез взаимодействие с други транскрипционни фактори, или активират цитоплазмени сигнални каскади. Тъй като ER α и β обикновено се изразяват съвместно, диференциалният анализ на функцията на всеки рецептор е експериментално предизвикателен. Използвахме добре характеризирана клетъчна линия на невробластом (SK-N-MC) без експресия на ER, стабилно трансфектиран с фалшив плазмид (SK-01), естрогенен рецептор α (SK-ER α) или естрогенен рецептор β (SK-ER β) . ). 28, 29, 30 Тези клетъчни линии ни позволяват да изследваме диференциалната функция на ER в туморни клетки при контролирани и добре описани условия. 21, 28, 30, 31, 32, 33, 34 В допълнение, ние също използвахме получена от пациент клетъчна линия на рак на гърдата MCF-7 като ER-положителен модел на рак на гърдата, експресиращ ERα, но не ERβ. Всички клетъчни линии се характеризират за експресия на ER чрез PCR анализ (Допълнителна фигура 1а). Както е описано по-горе, експресията на ER, както и повишената автофагична активност допринасят за метастатичен потенциал и резистентност към лечението на различни видове рак. 18, 35

неканоничната

Естрогенните рецептори диференцирано регулират генната експресия, свързана с автофагията. ( а ) Общата РНК от SK-01, SK-ER α, SK-ER β и MCF-7 клетки се характеризира с помощта на библиотеката Human Autophage Primer 1 (HATPL-1) и сравняване на ER-експресиращи клетки с фалшиво трансфектирани плазмидни контроли SK-01). Червените цифри означават регулация, по-висока от 1,5 пъти, сините цифри означават понижаване на регулацията, по-голяма от 1,5 пъти, тъмночервените цифри показват P-стойност

По-нататък изследвахме дали понижаването на нивата на ERα в MCF-7 клетки променя автофагичната активност, но нокдаун ER и не променя значително нивото на автофагичен поток или експресия на BAG3. Ясно е, че остатъчното количество на ERα експресия след нокдаун на RNAi все още е достатъчно, за да играе своята роля за увеличаване на неканоничната автофагия (Допълнителна фигура 5b). Тази интерпретация се подкрепя от наблюдения, че преходно свръхекспресиращи ERα в ER-отсъстващи естествени SK-N-MC клетки (предшественици на SK-01, SK-ER и и SK-ER β клетки) водят до повишен автофагичен поток и повишен BAG3 протеин. нива (Допълнителна фигура 5b).

За да потвърдим, че откритието ни за повишена експресия на автофагични маркери в ER α клетки отразява повишена автофагозомна биогенеза, а не намален автофагозомен клирънс, използвахме експресионен вектор (ptfLC3), кодиращ LC3, слят с червен флуоресцентен протеин (RFP) и зелен флуоресцентен протеин (GFP) в тандем (GFP-RFP-LC3). Ние показахме, че всички клетъчни линии показват червени флуоресцентни пункции без съответен сигнал в зеления канал при контролни условия, показващи непокътнато сливане на автофагозоми с лизозоми. В съответствие с резултатите от Western blotting на фигури 2a и b, ние наблюдаваме повишено натрупване на автофагозоми в ER-положителни клетки (Фигура 3a). Количественото определяне на GFP-RFP-LC3 пунктове във всяка клетъчна линия (Фигура 3b) допълнително подчертава нашите констатации и демонстрира значително по-големи количества автофаголизозомно образуване в ERα експресиращи клетки.

Инхибирането на късна фаза на автофагия от BafA 1 води до повишена клетъчна смърт в ER-експресиращи клетки и при излагане на H2O2-индуциран оксидативен стрес. SK-01, SK-ER a, SK-ER и MCF-7 клетки бяха третирани с контролна група на носител или 400 μM и 600 μM H 2 O 2 със или без BafA 1 (500 nM) в продължение на 24 часа и клетъчната смърт беше количествено определена чрез поточна цитометрия след оцветяване с пропидиев йодид. Стойностите на трите независими експеримента във всеки панел се изразяват като средната стойност ± SEM и представителни данни от експериментите са дадени в профилите на FACS разпръскване. (*) върху колони представлява статистическа значимост P 2, 17, 21, 47 Нокдаун BAG3 е придружен от намалени нива на LC3-II след лизозомно инхибиране в ER α-положителни клетки и в по-малка степен в SK-01 клетки, което показва, че понижаването на регулацията на BAG3 значително уврежда автофагичния поток (Фигури 6а до в). Интересното е, че при нокдаун с BAG3, медииран от siRNA и лечение с H 2 O 2, не открихме промени в клетъчната смърт в контролните клетки, но значително увеличение на чувствителността в ER α-експресиращи клетки (фигури 6d-f), които бяха дори по-високи като цяло отколкото след инхибиране на автофагията чрез лечения с BafA 1 (Фигури 5b ad).

Наблюдаваният ефект на BAG3 върху клетъчната преживяемост може да се обясни с ролята му в автофагията, но може да се дължи и на неговите антиапоптотични функции. Смята се, че тези рецептори се регулират от взаимодействието на BAG3 с антиапоптотичния фактор BCL2, което води до защита на клетките от апоптотична клетъчна смърт, 53. докато BAG3 също е установено, че отслабва протеотоксичността, водеща до индуцируема резистентност в туморните клетки. По-нататък се съобщава, че апоптозата на туморните клетки се индуцира от BAG3 заглушаване и засилва индуцираната от лекарството апоптоза на неопластичните клетки. 56, 57 По-нататък се съобщава, че BAG3 засяга интензивните пътища, регулирани от протеина на топлинния шок 70 (HSP70), които също са свързани с оцеляването на раковите клетки и апоптозата. 58

В съответствие с последните ни открития, резултатите от протеомния анализ показват ролята на BAG3 и основния Vault Protein като ефективни фактори за оцеляване, които допринасят за химиотерапевтичната резистентност в клетките на рака на гърдата. 59

Има ограничени данни за биомаркери и целеви протеини, които обикновено предсказват ефикасността на инхибиторите на автофагия при рак на гърдата. Следователно е необходима ефективна автофагална дисекция. Въвеждането на автофагични мрежи и индивидуални "автофагични отпечатъци" за пациентите може потенциално да подобри ефикасността на лекарствената терапия с автофагичен път, тъй като може да се използва специализирано лекарство канонично спрямо mTOR/PI3K-зависимо канонично автофагия. Това представлява основно предизвикателство за персонализираното развитие на медицината и биомаркерите, но също така и нова терапевтична възможност за пациенти с рак.

Материали и методи

Клетъчна култура

Човешки SK-N-MC клетки (ATCC HTB-10) и MCF-7 клетки бяха получени от American Type Cell Collection и култивирани, както е описано по-горе. Всички реагенти за третиране се разтварят в диметил сулфоксид (DMSO) и се използват при следните концентрации и интервали от време: 10 nM 17β-естрадиол (Е2, Sigma-Aldrich, Seelze, Германия) за 24 часа; 1 μM ICI 182780 (Tocris Biosciences, Бристол, Великобритания) за 24 часа; 500 nM бафиломицин А1 (Enzo Life Science, Farmingdale, NY, САЩ) за 6 часа; едновременно лечение с 1 μM Wortmannin (Sigma-Aldrich) и 100 nM бафиломицин А1 за 20 часа и 50 μM U0126 (Promega, Madison, WI, USA) за 48 часа. В случай на двойно третиране е извършен 1 час. Предварителна обработка с инхибиторен агент.

трансфекция

По метода на калциевия фосфат клетките се поставят в 6-ямкови плаки 24 часа преди трансфекцията. Всички реагенти се регулират до стайна температура (RT) и 10 μg плазмидна ДНК или 20 μg siRNA се смесват със 105 μl Н20 и 15 μl CaCl2 и се инкубират в продължение на 5 минути. Добавят се общо 120 μl 2x HEPES буфер и се инкубират в продължение на 30 минути. Суспензията се прехвърля директно в средата и след 24 часа се добавя прясна среда. Плазмидът GFP-RFP-LC3 (ptfLC3, Addgene, Cambridge, MA, USA) е използван за визуализиране на автофагична активност. След още 24 часа клетките бяха събрани или подложени на имуноцитохимия. Генерирането на pIRES-ER a и pIRES-ER β са описани по-горе 29, 30 и pIRES плазмидът е закупен от Clonetech Laboratories (Mountain View, CA, USA).

За siRNA-медиирана свръхекспресия и нокдаун, клетките се трансфектират, използвайки калциев фосфат или FuGENE метод (Promega). Подробности са дадени в допълнителната информация. Огромната siRNA (5'-AUUCUCCGAACGUGUCACG-3 ') е закупена като siMAX от MWG. анти-BAG3 siRNA се доставя от Sigma-Aldrich (SASI_Hs02_00337266). анти-DRAM1 siRNA смес се доставя от MWG (No. 1: 5'-ACACCUCCAGAGAGUGGUA-3 '; No. 2: 5-GGAUUAUGUAUAUCACGUA-3').

Western blot анализ

Анализът на Western blot се извършва, както е описано по-горе. 2 Анализът беше извършен със система Fusion-SL 3500 WL (Peqlab, Erlangen, Германия) и софтуер Aida Image Analyzer v.4v26 (Raytest, Straubenhardt, Германия).

имуноцитохимия

Клетъчната имуноцитохимия се извършва, както е описано по-горе. 2 Вградените в парафин туморни проби се депарафинизират и след това се рехидратират с ксилол, последвано от намаляващ диапазон от алкохоли (100% до 70% алкохол). Рехидратацията се прекратява чрез инкубация с най-предпочитаната вода и частите се съхраняват във вода, докато се открие антиген. След това се извършва имунооцветяване, както е описано по-горе. 2 Клетки и тъкани бяха анализирани микроскопски с помощта на обърнат Leica TCS SP5 (Wetzlar, Германия) и метаконфокален микроскоп Zeiss LSM710 (Oberkochen, Германия) и изображенията бяха обработени с Adobe Photoshop CS5 (Сан Хосе, Калифорния, САЩ) и Leica LAS AF (Leica Microsystems (UK) Ltd, Milton Keynes, Великобритания). Формирането на GFP-RFP-LC3 (визуализирано с помощта на горния експресионен плазмид на GFP-RFP-LC3) беше количествено определено чрез броене на петна в изображения на конфокална лазерна сканираща микроскопия, съответстващи на трансфектирани клетъчни линии и след третиране с Bafilomycin A1 (500 nM, 6 h) най-малко 56 клетки на клетъчна линия.

Трансмисионна електронна микроскопия

Подготовката на пробите и анализът на електронната микроскопия на проби бяха извършени, както е описано по-горе 63 и изображенията бяха обработени с Adobe Photoshop CS5.

антитела

Антителата, използвани за имуноцитохимия, както и за Western blot анализ в това проучване, са както следва: ATG7 (8558, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, USA); BAG3 (ab47124, Abcam, Кеймбридж, Великобритания); BCL2 (sc-492, Санта Круз, Далас, Тексас, САЩ); ERa (RM9101S0, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, САЩ); ERK1/2 (9102, клетъчни сигнални технологии); p-ERK1/2 (9106, клетъчни сигнални технологии); LC3B (L7543, Sigma-Aldrich); mTOR (OP97, Millipore, Billerica, MA, САЩ); p-mTOR S2448 (ab51044, Abcam); NBR1 (00004077-M01, Abnova, Тайпе, Тайван); SQSTM1 (GP62-C, Progen, Хайделберг, Германия); PI3K клас III (4263, клетъчни сигнални технологии); Тубулин (T9026, Sigma-Aldrich); WIPI1 (HPA007493, Sigma-Aldrich); Beclinl (ab51031; Abcam); p70S6K (9202, клетъчна сигнализация); p70S6K Thr389 (9206, клетъчна сигнализация). Вторичните антитела са антитела срещу мишка/заек/морско свинче, конюгирани с DyLight 488, 649 и Cy3 (имунофлуоресценция, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) или HRP (имуноблотинг, Jackson ImmunoResearch).

Човешка тъкан от рак на гърдата

Човешки проби от тумор на рак на гърдата са получени чрез операция при пациенти с рак. Подробности за пациентите с рак могат да бъдат намерени в Допълнителна таблица 1. Получено е информирано съгласие от всички субекти и проучванията са одобрени от Институционалните експертни групи и Етичния комитет на Сътрудническия център за туморни геранти (UCT) към Университета във Франкфурт.

PCR, PCR с обратна транскрипция и количествена PCR в реално време

PCR и количествената PCR в реално време се извършват, както е описано по-горе 21, като се използва HATPL-1 (Biomol, Хамбург, Германия) съгласно протокола на производителя. Обзорни промени и P стойности на целевите гени в SK-ER α, SK-ER и MCF-7 клетки в сравнение с SK-01 клетки бяха изчислени с помощта на RT 2 Profiler PCR Array Data Template Data Template v4.0 от Qiagen (Venlo, The Холандия)). Всички осем гена, натоварени в матричната плоча, бяха използвани като осем вътрешни контроли. Само гени с многократна промяна от +1, 5 или -1, 5 и P-стойност от P 64). Трансфекцията се извършва, както е описано по-горе. След 24 часа клетките бяха стимулирани със 17 β-естрадиол (10 пМ) и/или ICI (1 цМ) за 24 часа. Впоследствие клетките се събират чрез използване на система за анализ на луцифераза (Promega, Cat. No. E4030). Концентрациите на протеини се определят чрез BCA, както е описано по-горе, и показанията на луминесценцията се определят в автоматичен брояч (Wallac Victor2, PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Експериментите за трансфекция бяха проведени в три екземпляра, повторени три пъти и нормализирани за идентичен протеин.

Експерименти за оцеляване чрез флуоресцентно активирано сортиране на клетки (FACS)

Двадесет и четири часа преди стимулация SK-01, SK-ER a, SK-ER β и MCF-7 клетки бяха засяти в 24-ямкови плаки. След 1 h предварителна инкубация с бафиломицин А 1 (500 пМ) или DMSO, клетките се третират с контрол на носителя, 400 μ M или 600 μ M H 2 O 2 (Sigma-Aldrich) в продължение на 24 часа. След третирането супернатантата от клетките се събира и клетките се разтварят от плаките с трипсиново разграждане и отново се инкубират с предварително събраната супернатанта. След 5 минути центрофугиране (800 g) клетките се разделят в 100 μl PBS. Всички стъпки бяха извършени върху лед. Клетъчната жизнеспособност се измерва чрез оцветяване на клетки с пропидиев йодид (PI) (1 μ g/ml). Флуоресценцията на PI се определя с поточен цитометър FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Клетъчните популации бяха предварително затворени чрез разсейване напред (FSC-Height) и странично разсейване (SSC-Height). След това резултатите бяха анализирани със софтуера BD CellQuest Pro Analysis.

Статистически анализ

Количествените данни са изразени като средни стойности ± SEM Статистически сравнения между експериментални групи са направени с помощта на t-тест на Student. Вероятностните стойности на P ≤ 0,05 се считат за значими.