абстрактно

Основното

В сравнение с генотипната HLA-идентична трансплантация на костен мозък (BMT), несвързаното донорно присаждане (URD) ​​е свързано с по-висока смъртност. Тежката остра болест присадка срещу гостоприемник (aGVHD) и неуспехът на присадката са основните причини за свързаната с трансплантацията смъртност (TRM) в тази обстановка и могат да бъдат свързани със степента на HLA несъвместимост.

Предишните стандарти за HLA типизиране включват серологични методи за HLA-A и -B молекули и ДНК-базиран HLA-DRB1 типизиране. Идентичността на донора-реципиент HLA-DRB1 намалява риска от aGVHD и подобрява преживяемостта след URD-BMT.5678 Въпреки това, рискът от aGVHD, неуспех на присадката и смърт остава по-висок при пациенти, които са трансплантирани с HLA-A, -B и -DRB1. сред трансплантираните с HLA-идентични братя и сестри.1 Последните проучвания показват, че тези усложнения могат да бъдат резултат от разликите между HLA-A и -B между пациент и донор.89101112 Всъщност на молекулярно ниво са описани повече от 300 алела. 85 серологично дефинирани антигени от клас I.13 В допълнение, серологично двойките HLA-A и -B "сдвоени" всъщност често са несъответстващи на HLA-C. 141516 Въпреки това клиничните последици от такива несъответствия изглеждат неясни. В изследване на Petersdorf et al. Несъответствията от 10 HLA клас I корелират повече с неуспех на присадката, отколкото с остра GVHD и засягат оцеляването само в случаи с множество несъответствия. За разлика от това, в проучване на Sasazuki et al, 9, дори едно несъответствие на HLA-A или B повлиява оцеляването чрез увеличаване на тежка остра GVHD. В това проучване несъответствието на C-локуса е свързано с намалена честота на рецидиви и ефектът от несъответствие от клас I върху клиничния резултат изглежда е дори по-важен от несъответствието от клас II.

В допълнение към молекулярното типизиране са разработени клетъчни тестове, за да се предскаже ефектът от разликите на HLA клас I върху вероятността за aGVHD. Те се състоят от определяне на честотата на цитотоксичните донорни прекурсори на Т-клетки (CTLp) с анти-реципиентна специфичност (посока на GVHD) .17 Ниските честоти на CTLp силно корелират с HLA-A и -B идентични.

Тъй като използването на URD-BMT се увеличава с увеличаването на размера на донорските регистри, спешно са необходими повече данни по тази тема за подобряване на клиничната практика и е необходима ретроспективна оценка на предишния опит за всеки клиничен екип на BMT. Целта на това проучване е да се определи ефектът от разликите в HLA клас I и II върху изхода на пациента след URD-BMT. Преработихме HLA клас I и II, използвайки ДНК техники с висока разделителна способност в 69 двойки донори реципиенти, трансплантирани между септември 1988 г. и юни 1998 г. в нашата институция. Честотите на CTLp също бяха определени в 33 от тези двойки.

Материали и методи

BMT процедура

Изследването включва 69 последователни процедури за URD-BMT, извършени между септември 1988 г. и юни 1998 г. в университетската болница „Анри-Мондор“ (Таблица 1). Трима пациенти са трансплантирани два пъти. Донорите бяха идентифицирани чрез европейски и NMDP регистри. Основните характеристики на пациентите преди BMT са обобщени в таблица 1. Пациентите са разделени на две групи според състоянието на заболяването при BMT: 32 реципиента с ХМЛ в първата хронична фаза или остра левкемия в първата или втората ремисия формират стандартната рискова група . и 37 пациенти с по-напреднал BMT са били във високорисковата група.

Маса в пълен размер

Първите 66 процедури за BMT са извършени след миелоаблативно кондициониране, включително общо облъчване на тялото (n = 59) или режим на базата на бусулфан (n = 7). Извършени са три секунди присадки с използване на друг донор след прокарбазин-циклофосфамид и антитимоцитен глобулин. Профилактиката на GVHD комбинира циклоспорин и метотрексат съгласно протокола от Сиатъл.18 Всички пациенти са получили немодифициран костен мозък. Острият GVHD е класифициран, както е дефиниран от Glucksberg et al .19, и е лекуван със стандартни дози стероиди, в случай на неуспех с високи дози стероиди или ATG.

HLA типизиране и сдвояване пациент-донор

HLA типизиране преди BMT:

Донорите бяха избрани въз основа на HLA-A и -B типизиране, използвайки техниката на микролимфоцитотоксичност20, която идентифицира съответните специфики, признати от Световната здравна организация (СЗО) по време на трансплантацията. Типирането на HLA клас II се извършва по техники, налични по време на трансплантацията. По този начин фенотиповете HLA-DR и -DQ са изследвани при ниска разделителна способност при 14 двойки, използвайки серология (n = 3) или RFLP (полиморфизъм на дължината на рестрикционен фрагмент) (n = 11), докато в останалите 55 двойки, HLA-DRB1, Типирането на -DQB1 и -DPB1 беше извършено с висока разделителна способност с PCR обратна точка (Innogenetics, Брюксел, Белгия) плюс PCR-RFLP2122 за HLA-DRB1 и -DQB1.

Ретроспективно HLA въвеждане:

Типирането на HLA клас I се извършва ретроспективно, като се използва PCR-SSP (грунд, специфичен за последователността) (Dynal, Осло, Норвегия).

HLA-A и HLA-B серологичните "заготовки" бяха повторно набрани, като се използва ДНК типиране с ниска разделителна способност. Всички серологично експресирани HLA-A антигени са определени на алелно ниво. Серологично експресираните HLA-B антигени бяха дефинирани с висока разделителна способност според наличността на търговски комплекти (HLA-B фенотипът беше напълно дефиниран с висока разделителна способност при 39 от 69 двойки донори-реципиенти). Локусът на HLA-C е изследван чрез техниката, определяща алелите Cw1-18.

HLA-DRB1, -DQB1 и -DPB1 бяха пренаписани в 14 двойки донор-реципиент, предварително написани при ниска резолюция.

Изчисляване на честотите на CTL-p

CTLp анализите се извършват, както е описано в Kaminski et al. 17 Накратко, анализите се извършват в „GVHD посока“, като се използват донорски клетки като реагиращи клетки и реципиентни клетки като стимулиращи клетки. Кладенците се считат за положителни, ако освобождаването им от 51 Cr е по-голямо от средното плюс 3 стандартни отклонения (sd) на отрицателния контрол (стимулиращи клетки без клетки, реагиращи на клетките). Честотите на CTLp под 1/300000 се считат за отрицателни

Статистически методи

Данните бяха събрани и актуализирани към 15 ноември 1998 г., осигурявайки минимално проследяване от 7 месеца, максимум 122 месеца и средна преживяемост от 29 месеца (диапазон 7 - 122 месеца). Очакваните вероятности за aGVHD, TRM и оцеляване бяха изчислени и начертани по метода на Kaplan-Meier и сравнени с помощта на log-rank тест. Пациентите, подложени на втората трансплантация, бяха цензурирани за първата трансплантация в деня на втората BMT.

резултатът

Честоти на HLA типизиране и pCTL

По време на трансплантацията беше известно, че шест двойки донори-реципиенти не съответстват нито на HLA-A, нито на -B антиген (UPN 671, 588, 536, 620, 629, 643); две двойки бяха HLA-DQB1 несъответстващи (UPN 495, 547) и една двойка бяха HLA-A и -DQB несъответстващи (UPN 502) (Таблица 2).

Маса в пълен размер

Ретроспективно типизиране на ДНК потвърди всички серологично идентифицирани несъответствия. Допълнителни несъответствия бяха открити в седем от деветте известни несвързани двойки донор-реципиент (Таблица 2). Сред 60 двойки други донори реципиенти, HLA несъответствия, които не са били идентифицирани по време на трансплантацията, са открити при 27/60 (45%), докато 33/60 (55%) двойки са потвърдени, че съответстват на HLA-A, - B Алели -C, -DRB1 и -DQB1. По този начин след ретроспективно типизиране 36/69 (52%) от двойките донори-реципиенти не съвпадат. От тези двойки 27 са несъответстващи само с HLA антигени от клас I, пет двойки са несъответстващи само с антигени от HLA клас II и четири несъответстват за антигени от HLA клас I и клас II.

HLA клас I

Серологично празни фенотипове винаги са били потвърждавани чрез типово определяне на ДНК с ниска резолюция, което също показва, че един индивид е бил неправилно идентифициран чрез серологично типизиране (HLA-B57 (17) вместо HLA-B58 (17) (UPN 502)). Сред 62 двойки, които са серологично HLA-A и -B отговорили по време на трансплантацията, са открити несъответствия на HLA-A и/или -B в 13 след ретроспективно типизиране (Таблици 2 и 3). HLA-B антигените бяха определени чрез типизиране с висока разделителна способност при 17/33 сдвоени двойки донори и реципиенти и 22/36 несъответстващи двойки.

Маса в пълен размер

Сред 69 двойки имаше 23 несъответствия на HLA-C (Таблица 3). Десет са имали само едно несъответствие на HLA-C антиген, докато 12 също са имали несъответствия HLA-A и/или -B и един също е имал едно несъответствие HLA клас II (Таблици 2 и 4). Всички молекули HLA-B са написани с висока разделителна способност в 10 двойки с несъответствие на HLA-C. По този начин, след ретроспективно типизиране на ДНК, 31/69 (45%) двойки имат поне едно несъответствие на HLA клас I.

Маса в пълен размер

HLA клас II

Сред 14-те двойки донори реципиенти, които са били фенотипирани с ниска резолюция по време на трансплантацията, са открити несъответствия при ретроспективно типизиране при шест вероятно двойки идентични донори - реципиенти на HLA клас II; три от тях са несъответстващи на HLA-DQB1 (UPN 392, 441, 380), един е несъответстващ на HLA-DRB1 и -DQB1 (UPN 373) и два са несъответстващи на HLA клас I и клас II (UPN 426, 306) (Таблица 2 )). Двойка от 9/69 донори реципиенти следователно не отговаря на HLA клас II.

Типирането на HLA-DPB1 показва, че само девет двойки пациент-донор са били сдвоени в това отношение. Общо само пет двойки HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 и -DPB1 бяха идентични.

Хаплотипове на предците

За да определим дали е възможно да се предскаже честотата на несъответствие, открито чрез типизиране на ДНК с висока разделителна способност въз основа на запазени хаплотипове, класифицирахме HLA фенотипите на двойките донори-реципиенти, идентифицирани по време на трансплантацията, въз основа на вероятното присъствие на един или два от 25 предци на HLA-ABDR хаплотипове (AH), дефинирани от Christiansen et al. регламент). Две двойки могат да имат две AH, 29 една AH и 30 без AH. Сред анализираните 122 хаплотипа, несъответствията от HLA клас I са по-чести след ДНК с висока разделителна способност в хаплотипове, които се считат за неродени, отколкото при AH (21/89 срещу 2/33) (P = 0,017 точен тест на Фишър).

Честотите на CTLp бяха определени за 33 двойки. След типизиране на ДНК, 14 двойки HLA клас I са несъответстващи в посока GVHD и 19 двойки са сдвоени (таблица 5). Сред 14-те двойки, които не съвпадат, е открита висока честота на CTLp при девет двойки и ниска честота при пет двойки. От тези пет последни двойки, две бяха HLA-A несъответствия (UPN 671, 547), една беше HLA-B несъответствие (UPN 642) и две бяха HLA-C несъответствия (UPN 680, 668). Ниски честоти на CTLp са открити при 19 двойки в посока GVHD.

Маса в пълен размер

да хвана

Шест пациенти са починали преди 30 ден след трансплантацията, което показва, че 63 присадки могат да бъдат оценени. Неуспех на присадката се е случил в пет случая. Четири от петте двойки са HLA клас I, несъответстващи в посока HVG (хост срещу присадка) (UPN 526, 436, 617, 536), а едната е идентична. Двама пациенти са имали едно несъответствие на HLA-C антиген (UPN 617, 436), един е имал едно несъответствие на HLA-B антиген (UPN 526), ​​а един е имал несъответствие HLA-B и -C (UPN 536).

AGVHD, TRM и оцеляване

Деветнадесет от 66 пациенти са живи (медиана 28 месеца, диапазон 7–122 месеца след BMT), включително пациенти с автоложно разтваряне (UPN 617) и пациенти с рецидив на лимфом (UPN 600). Общата степен на преживяемост за цялата кохорта е 28 ± 6% и стойностите корелират с хематологичния статус (55% срещу 9%) (P

клас

Оценки на преживяемостта на Kaplan-Meier за пациенти със „стандартен рисков статус“ (плътна линия) в сравнение с пациенти с „високорисков статус“ (пунктирана линия). Вероятността за оцеляване е била 55% за пациенти със стандартен риск и 9% за пациенти с висок риск (P

Оценки на преживяемостта на Kaplan-Meier при пациенти, които са претърпели HLA клас I и II трансплантации (плътна линия) в сравнение с тези, които са получили HLA клас I и/или II трансплантации (пунктирана линия). Вероятността за оцеляване е била 40% при пациентите с отговор и 20% при пациентите без отговор (P

Вероятност за степен III-IV aGVHD при HLA-съвместими (плътна линия) и HLA-несъответстващи трансплантации (пунктирана линия). Сред пациентите, които могат да бъдат оценени за GVHD, 2/30 съвпадащи пациенти и 16/33 несъответстващи пациенти развиват тежък aGVHD (P

Оценки на преживяемостта на Kaplan-Meier при пациенти, които са получили съответстващи трансплантации на HLA клас I и II (плътна линия) в сравнение с тези, които са били подложени на несъответстващи трансплантации на HLA клас I (пунктирана линия). Вероятността за оцеляване е 42% за трансплантации, съответстващи на HLA клас I и II и 18% за трансплантации, съответстващи на HLA клас I и клас II несъответствия (P

Сравнение на оценките за преживяемост на Каплан-Майер в четири подгрупи: "статут на стандартен риск" и съответните трансплантации; "Стандартно състояние на риск" и несъответстващи трансплантации; „Състояние с висок риск“ и съответни трансплантации; "Високорискови" и противоречиви трансплантации. Вероятността за оцеляване е 66%, 31%, 9% и 8%.

Изображение в пълен размер

дискусия

Нашето проучване ясно потвърждава, че оцеляването след URD-BMT може да се подобри чрез съвпадение на донор-реципиент за HLA-A, -B, -C при високо ниво на разделителна способност, което предполага, че несъвместимостта на HLA е открита само при типизиране с висока резолюция (т.е. липсва конвенционални техники) са клинично значими. Въпреки че това е известно за сдвояването HLA клас II от няколко години, то е определено за HLA клас I само от две скорошни проучвания.910 Нашето проучване показва висока честота на несъответствие на HLA клас I между HLA-A и -B серологично идентичен донор -получатели двойки. Всъщност, HLA-A и/или -B алелни несъответствия са открити в 13/62 (21%) серологично сдвоени двойки и в 6/7 (86%) двойки, за които е известно, че не са съвпаднали по време на трансплантацията. В допълнение, това проучване подчертава високата честота на HLA-C несъответствие (23/69, 33%), което се е случило в 11/23 случая без HLA-A и/или -B несъответствие.

Интересното е, че нашият анализ предполага, че AH са по-рядко свързани с HLA клас I алелни различия, в съответствие с проучването на Prasad et al. 12 Трябва обаче да се отбележи, че сегрегацията на AH се основава на изчисление на вероятността и не може да бъде определена. донорски семейни изследвания.

Наскоро CTLp анализи бяха въведени в много трансплантационни единици, за да се открият липсващи несъответствия на HLA клас I или да се предскаже aGVHD.8 В нашия център резултатите от CTLp бяха използвани за избор на донори преди трансплантацията и донори с най-високи CTLp анализи бяха отстранени. В това проучване, при сравняване на CTLp и ДНК типизиране, високите CTLp анализи винаги са били свързани с HLA несъответствие от клас I. Въпреки това, отрицателни CTLp анализи са наблюдавани в пет двойки въпреки GVHD несъответствие (включително три случая на HLA-A несъответствие или - B), което е в съответствие с изследването на Scott et al. 11 CTLp може да бъде полезен за откриване на пермисивни несъответствия на HLA клас I. \ T Въпреки това, появата на тежка aGVHD при двама от четирима пациенти с несъответствия само от HLA клас I и отрицателни CTLp тестове не ни позволява да потвърдим тази възможност.

Наскоро две проучвания показаха корелация между съответствие с HLA клас I и клиничен резултат.910 Sasazuki et al 9 установиха корелация между несъответствието на HLA-A, -B и -C и високата честота на тежки aGVHD, докато несъответствието от клас I е свързано с отхвърляне на присадката в проучването. Petersdorf et al, 10, особено за HLA-C локуса.24 От друга страна, Sasazuki et al установяват, че сдвояването на HLA-C корелира с риска от рецидив на левкемия 21, което може да се обясни с инхибиране на активността на NK клетки в случаи на идентичност с HLA-C между донора и Различните резултати между двете проучвания могат да се обяснят с разлики в етническия произход и хематологичното заболяване (пациенти с ХМЛ спрямо националния регистър). В нашето проучване се наблюдава висока смъртност, свързана с трансплантацията, при пациенти с несъответствие на HLA клас I поради високата честота на тежки aGVHD. Освен това при тази група пациенти са наблюдавани 4/5 случая на неуспех на присадката. По този начин несъответствието на HLA-C може да бъде свързано с тежък aGVHD, както и с неуспех на присадката, потвърждавайки ролята на HLA-C като трансплантационен антиген. Влиянието на идентичността на HLA-C върху рецидивите на левкемия не може да бъде анализирано в нашата работа поради малкия брой двойки донори-реципиенти.

В заключение, геномното типизиране на HLA алеи от клас I и II допринася значително за успеха на трансплантацията от несвързани донори, като средната преживяемост в същата група е сравнима с преживяемостта при трансплантация с генетично идентични братя и сестри. Лошата прогноза на пациентите, които са претърпели не-HLA трансплантация, предполага необходимостта от нови методи за трансплантация.