абстрактно

Няколко гена на тирозин киназа участват в хромозомни транслокации при хронични миелопролиферативни нарушения, но в някои случаи все още съществуват нестандартизирани транслокации. Ние съобщаваме за два такива случая, съответстващи на атипична хронична миелоидна левкемия с транслокация (8; 9) (p22; p24). Чрез флуоресценция in situ хибридизация (FISH) на съответните метафази с бактериална изкуствена хромозомна сонда, включваща гена на janus киназа 2 (JAK2) при 9p24, наблюдаваме разпределение и при двамата пациенти, което показва, че този ген е пренареден. Локусът 8p22 съдържа различни гени-кандидати, включително гена за перицентриорен материал 1 (PCM1), който вече участва в реципрочни транслокации. Пренареждането на гена PCM1 беше демонстрирано от FISH и при двамата пациенти. RT-PCR потвърждава сливането на 3 ′ част от JAK2 с 5 ′ част на PCM1. Анализът на последователността на химерната мРНК на PCM1-JAK2 показва, че предполагаемият протеин има домени на PCM1 спирала и домейни на JAK2 тирозин киназа. Тази нова транслокация идентифицира JAK2 като потенциална терапевтична цел за съединения с антитирозин киназна активност.

Основното

От хроничните миелопролиферативни разстройства хроничната миелоидна левкемия е парадигма, тъй като е свързана с реципрочна транслокация, включваща гена на Abelson тирозин киназа (ABL) (Heisterkamp et al., 1983). Транслокацията на t (9; 22) (q34; q11) произвежда BCR-ABL слят протеин с активност на тирозин киназа, който може да бъде блокиран от малко съединение, иматиниб мезилат (STI571) (Druker et al., 2001). При някои пациенти с клинични характеристики на ХМЛ (атипична ХМЛ) са включени други гени, кодиращи тирозин кинази, като PDGFRA (Baxter et al., 2002; Trempat et al., 2003) и PDGFRB (Baxter et al., 2003).

В това проучване ние докладваме два случая на атипична ХМЛ с една и съща t (8; 9) (p22; p24) транслокация. Един от кандидат-гените, участващи в тази нова транслокация, е много вероятно да принадлежи към групата гени, кодиращи протеини с активност на тирозин киназа. Генът на janus kinase 2 (JAK2) е добър кандидат, тъй като се намира на 9p24. Всъщност JAK2 е описан в няколко случая на T-ALL (Lacronique et al., 1997), B-ALL и атипичен CML (Peeters et al., 1997), в които той е слят с TEL/ETV6. В допълнение, няколко групи (Baxter et al., 2005; James et al., 2005; Levine et al., 2005) съобщават, че единствената придобита активираща мутация на JAK2 (Val617Phe) е наблюдавана при повечето пациенти с полицитемия вера, есенциална тромбоцитемия и идиопатична миелофиброза, подчертавайки ролята на тази киназа при миелопролиферативни заболявания.

Изследванията, които извършихме, се основаваха на предположението, че генът JAK2 е пренареден в туморните клетки на двама пациенти. Те ни позволиха да характеризираме нова реципрочна транслокация с PCM1 синтез при 8p22 с JAK2 при 9p24.

Пациент 1, 46-годишен мъж, е хоспитализиран през януари 1998 г. за астения, загуба на тегло и аномалии в кръвта. При физически преглед пациентът показа бледа кожа, но няма признаци на увеличение на черния дроб или далака. Лабораторните резултати показват анемия (хемоглобин = 11,9 g/dl), хиперлевкоцитоза (WBC = 11,8 × 10 9/l) и нормални тромбоцити. Броят на левкоцитите показва 28% незрели гранулоцити, 2% еритробласти, но няма хипереозинофилия. Мазки от костен мозък и биопсия на трефин потвърдиха хиперплазия на костния мозък с миелофиброза, но без миелодисплазия. Хромозомният анализ на клетките на костния мозък показва изолирана t (8; 9) (p22; p24) транслокация без филаделфийската хромозома. Окончателната диагноза е атипична ХМЛ. Пациентът е бил лекуван с Hydrea и е получил алогенна трансплантация на костен мозък през август 1998 г. Той се възстанови от хематопоезата след 1 месец, но почина през януари 1999 г. от инфекциозна пневмония, свързана с хемофагоцитен синдром.

Пациент 2, 44-годишен мъж, е приет в болница през ноември 2004 г. след едномесечна анамнеза за дясна надключична маса с парализа на ръката и анестезия на брадичката (V-черепно-мозъчен нерв). По това време броят на кръвните клетки показва хиперлейкоцитоза (WBC = 45, 8 × 10 9/l) с 21% еозинофили, 30% незрели гранулоцити, 4% бласти и 1% еритробласти. Аспирацията на костен мозък е хиперклетъчна и излага 54% от пероксидазно-положителните миелобласти и 24% от еозинофилите. Не са наблюдавани признаци на миелодисплазия. Поставена е диагноза AML M2 с еозинофилия, разработена в условията на атипична ХМЛ. Хромозомният анализ разкрива анормален кариотип с изолирана t (8; 9) транслокация (p22; p24). Пациентът е лекуван с комбинирана химиотерапия, включително идарубицин и арацитин, свързани с менингеална профилактика. След месец той достигна пълна ремисия. Лечението беше прекратено чрез лъчетерапия до твърдо вещество, диагностицирано при влизане.

Различни FISH сонди, специфични за ABL и FGFR1 (8p11), бяха тествани и потвърдиха липсата на пренареждане на тези гени в два случая (данните не са показани). Следователно, ние търсихме присъствието на кандидат-гени за 8p22 и 9p24. Изследването на множествените гени, съобщени за 9р24, категорично показва, че е включен JAK2, кодиращ тирозин киназа. В допълнение, JAK2 е описан в (9; 12) (p24; p13) в няколко случая на остра лимфобластна левкемия и хронични миелопролиферативни нарушения (Lacronique et al., 1997; Peeters et al., 1997). Поради тези причини тествахме метафазни хромозоми, използвайки FISH със съответната JAK2 BAC сонда (RP11-927H16), маркирана с ник транслация от биотин, както беше описано по-рано (Trempat et al., 2003). И в двата случая е записан разделен сигнал: едната част на хромозома 9p24, а другата част на 8p22 (Фигура 1, 1а).

хронична

FISH анализ: Флуоресценция in situ хибридизация с сонда JAK2 (BAC RP11-927H16) и маркирана с биотин и дигоксигенин PCM1 сонда (BAC RP11-484L21), съответно, като се използва комплект за превод на ник (Amersham pharmacia biotech) съгласно инструкциите на производителя. Пациент 1: (1а) FISH с сонда JAK2 (Baxter et al.), Сигналът е разделен между производни хромозоми 9 и 8 (стрелки). (1b) FISH със сонди JAK2 (зелен) и PCM1 (червен), тези два сигнала са разделени (стрелки: синтезни сигнали на получени хромозоми 8 и 9). Пациент 2: метафаза (2а) и съответната FISH (2b) със сонди JAK2 (зелено) и PCM1 (червено), тези два сигнала са разделени (стрелки: синтезни сигнали). Останалите сигнали съответстват на нетранслоцирани хромозоми 8 и 9. JAK2 и PCM1 са пренаредени в тези два случая.

Изображение в пълен размер

Разглеждайки локуса 8p22, най-добрият кандидат беше показан гена на перицентриоларния материал 1 (PCM1), който преди това беше описан в реципрочна транслокация, генерираща синтезен ген с RET при 10q11 (Corvi et al., 2000). Следователно, ние проектирахме набори от праймери в рамките на 3 'кодиращи последователности на JAK2 (съответстващи на TK домейна) и в 5' кодиращата област на PCM1 и генерирахме RT-PCR анализ на общата РНК от туморни клетки на двамата пациенти. Продуктът от 4 kb е получен с РНК на пациент 1 (Фигура 2). След секвениране, този продукт съответства на предполагаемата 9401 bp иРНК. Структурата на отворената рамка за четене на химерната транскрипция PCM1-JAK2 показа, че PCM1 exon 37 (NM_006197) е в рамка с JAK2 exon 9 (NM_004972). Тази структура демонстрира запазването на всички навити домени PCM1 домейни и JAK2 тирозин киназен домен (Фигура 3). Обратната транскрипция JAK2-PCM1 се открива от съответните праймери (Фигура 2). Получава се PCR продукт от приблизително 700 bp от 2363 bp в рамка сливане. Поради значителна деградация на РНК, RT-PCR при пациент 2 остава неуспешен. Сливането на PCM1 с JAK2 обаче беше потвърдено от FISH и при двамата пациенти (Фигури 1b, 2a, b).

RT-PCR анализ на химерния транскрипт PCM1-JAK2: Общата РНК беше екстрахирана по метода Trizol (Gibco-BRL) и обратна транскрипция с помощта на комплект за усилване на Маратон cDNA (BD Biosciences). PCR се извършва с BD, за предпочитане 2 PCR ензимна система (BD Biosciences), съгласно инструкциите на производителя. 4 kbp продукт и 700 bp PCR продукт са получени с праймери PcmF/JakK и JakC/PcmO (виж последователностите по-долу). Всяка PCR реакция се провежда с празна проба, съответстваща на PCR смес без въведена cDNA. Показаното на фигурата заготовка съответства на отрицателния контрол на PCR реакцията PCM1-JAK2. PCR продуктите се пречистват с помощта на QIAquick PCR комплект за пречистване (Qiagen). Вътрешният грунд JakF беше използван за секвениране на точката на прекъсване между PCM1 и JAK2, използвайки комплекта ABI Prism Dye Terminator (Perkin-Elmer Applied Biosystem). PcmF IndexTerm 5′-TACAGCTGTCAGCTGCTAGTGTGGG-3 ′; PcmO IndexTerm 5′-TGGGCTCCCACCGTTTCACCTTCTT-3 ′; JakK IndexTerm 5′-CATCTGGGCATCCATCTGGTCTTGG-3 ′; JakF IndexTerm 5′-CTCGTCTCCACAGACACATACTCCAT-3 ′; JakC IndexTerm 5′-ACTGGAAACGGTGGAATTCAGTGGTC-3 ′

Изображение в пълен размер

Последователност на новия транскрипт на синтез: ( а ) Отворена рамка за четене на химерния ген PCM1-JAK2. ( б ) PCM1, PCM1-JAK2 и JAK2 иРНК структура. CCD, домейн с навита намотка; JH2, JAK хомологичен/псевдокиназен домен на JAK2; PTK, протеин тирозин киназа

Изображение в пълен размер

В нашето проучване партньорският ген на JAK2 е PCM1, който кодира 228 kD протеин, съдържащ няколко потенциални домена на спирала в своята амино-терминална част (Balczon et al., 1994). Този протеин се намира в цитоплазмени гранули, наречени центроларни сателити. Експериментите, насочени към блокиране на активността на PCM1 или с антитела срещу PCM1, или с малки интерфериращи РНК, водят до нарушено сглобяване на центрозомни протеини и организиране на микротубули, което предполага, че PCM1 играе ключова роля в тези процеси (Dammermann et al., 2004), особено в клетъчния цикъл прогресия. (Balczon et al., 2002). Генът PCM1 съответства на хромозомна област, която често се губи при ракови заболявания (Emi et al., 1992; Bhattacharya et al., 2003), но неговата роля в t (8; 10) (p22; q11) транслокация в тироидната езофагеална папила ракът привлече вниманието ни към възможните последици за химерните протеини като PCM1-RET. В допълнение, в последния случай неговият партньор е рецептор с активност на тирозин киназа (Corvi et al., 2000).

Тъй като има относителна повсеместна експресия на РСМ1, вероятно РСМ1 промоторът потиска експресията на слят ген PCM1-JAK2, в който карбоксилният край съответства на каталитичната активност на JAK2. Поради наличието на мулти-свързващи домейни в амино-терминалната част на PCM1, възможно е PCM1-JAK2 химерата да претърпи олигомеризация, което да доведе до активиране на JAK2 тирозин киназния домен. Необходими са по-нататъшни експерименти in vitro, за да се потвърди, че пътищата JAK/STAT и PI3'-Киназа/AKT са конститутивно активирани в отговор на автофосфорилирането на PCM1-JAK2.

Тук описахме два случая на нов вариант на транслокация, включващ гените PCM1 и JAK2. Идентифицирането на тези два партньорски гена би спомогнало за по-нататъшно характеризиране на нови случаи на миелопролиферативни нарушения с такава транслокация и за проследяване на остатъчното заболяване след лечението. Клиничното представяне на нашите пациенти беше малко по-различно, но и двамата имаха опит в атипична ХМЛ. Един пациент обаче е диагностициран в хронична фаза без хипереозинофилия, докато другият е изследван в острата фаза (циркулиращи незрели клетки на костния мозък с бластна криза и хипереозинофилия).

В по-обещаваща перспектива може да се приеме, че JAK2 ще бъде добра цел за нови съединения с антитирозин киназна активност.

Благодаря

Благодарим на д-р Storlazzi, Университет в Милано, и д-р Max Chaffanet, INSERM U119, Марсилия, за щедрия подарък, съответно на BAC JAK2 (RP11-927H16) и PCM1 (RP11-484L21). Специални благодарности на Dr. Fabienne Meggetto и Jean-Pierre Jaffrezou, INSERM U563 CPTP, Тулуза, Франция, за критично четене на ръкописа.

Безвъзмездни средства: Cancéropole Grand Sud Ouest, Лига срещу рака, Комитети на Gers и de Haute Garonne