елементи

абстрактно

Затлъстяването и свързаните с него метаболитни заболявания нарастват в световен мащаб, докато безопасното и ефективно лечение на затлъстяването остава неуловимо. Тъй като приемът на храна и телесното тегло се контролират от централната нервна система (ЦНС), разбирането на сложните механизми на ЦНС, които регулират енергийната хомеостаза, е от съществено значение за откриването на успешни терапевтични средства срещу затлъстяването.

Страничният хипоталамус (LH) е исторически известен като критичен „център за хранене“ и силен координатор на стремежа към хранене, пиене и упражнения. Ключовата роля на това ядро ​​в контрола на храненето е може би най-ясно илюстрирана от дълбоката афазия, предизвикана от двустранни LH лезии. 1, 2, 3, 4 За разлика от това, LH стимулацията предизвиква диета, дори при наситени плъхове. Това ядро ​​също е проектирано като интерфейс между хомеостатичен и хедоничен контрол на храненето. Плъховете с нетърпение натискат лоста, за да стимулират своя LH, което предполага, че самото активиране на LH е полезно. 6, 7, 8

Храната може да бъде много ефективен стимулиращ стимул. Консумацията на храна и възнаграждението се управляват отчасти от различни и частично припокриващи се ядра на мозъка: области, които реагират на хормонални и метаболитни сигнали, получени от периферията и другаде в мозъка. 9, 10 Мезолимбичните невроциркулатори, особено вентралната тегментална зона (VTA) и нейните допаминергични проекции в ядрото на акумула (NAc), са получили голяма част от вниманието при нервен контрол на възнаграждението за храна. 11, 12, 13 LH всъщност е най-силният самостимулиращ се център в мозъка и тъй като плъховете на гладно/ограничени с храна самостимулират дори повече от хранените плъхове, взаимодействието между метаболитния статус и възнаграждението може да изисква обработка от този мозък ядро. 7, 14, въпреки че също така е възможно стимулирането на снопа на средния преден мозък, който свързва VTA с NAc и пресича LH, може да допринесе за потенциращите ефекти на вътречерепните изследвания за самостимулация. LH се инервира от глюкагоноподобни пептид-1 неврони (GLP-1) и GLP-1R рецептори (GLP-1R), експресирани в LH. 16 Възможното въздействие на това съобщение върху възнагражденията е до голяма степен неизследвано.

Материали и методи

Мъжки и женски плъхове Sprague-Dawley (на възраст 5 седмици при пристигане, река Чарлз, Сулцфелд, Германия) бяха поставени в 12-часов цикъл светлина/тъмнина (светлина в 07:00) в отделни клетки с достъп до лирата ad libitum. Глобална 16% протеинова диета с гризачи (2016), Envigo, Huntingdon, UK) и вода, освен ако не е посочено друго. Всички проучвания са извършени с етично разрешение от Комитета за хуманно отношение към животните към Университета в Гьотеборг в съответствие със законовите изисквания на Европейската общност (Указ 86/609/ЕИО). Направени са всички усилия за свеждане до минимум на страданието.

наркотици

Ex4 и антагонистът на GLP-1R екзендин-9 (Ex9) са закупени от Tocris (Бристол, Великобритания), разтворени в изкуствена цереброспинална течност (Tocris; използвани като носител) и съхранявани като аликвоти при -20 ° C.

Мозъчна канюлация

Водещите канюли са имплантирани в LH, както е описано по-горе (вж. Допълнителната информация за подробности). С избрани координати нашите манипулации/инжекции последователно постигнаха централен, страничен и дорзален LH. Инжекциите могат да достигнат и зона incerta; обаче, за разлика от LH, този регион не изразява GLP-1R 16 (допълнителна фигура S1).

Оперативно кондициониране

Процедурата за хирургично кондициониране се използва за оценка на мотивацията за получаване на награда, в този случай хранителна награда под формата на петрол от захароза (45 mg TestDiet, Richmond, IN, USA). Обучението и тестването бяха извършени, както е описано по-горе 30, 31 и в допълнителната информация. Всички тестове за оперативна реакция са извършени в прогресивно съотношение (PR).

Ефекти от фармакологично активиране или блокада на LH GLP-1R върху приема на храна, телесно тегло, физическа активност и мотивирано от храната поведение

За да се тестват ефектите от активирането на GLP-1R, на 11-седмични плъхове се инжектира Ex4 (0, 05 или 0,15 μg) или носител (изкуствена цереброспинална течност) и оперативният отговор на операцията се тества 20 минути след инжектирането. В допълнение, ефектът от естрозния цикъл върху активирането на LH GLP-1R беше оценен в отделна група от 8-седмични жени (вж. Допълнителна информация). В експерименти, изследващи ефекта на блокадата на GLP-1R, плъхове на възраст над 11 седмици са гладували цяла нощ, след това са получавали брашно за 20 минути и са инжектирани с Ex9 (10 μg) веднага след хранене. Този дизайн е модифициран от Hayes et al. 32 и се използва за индуциране на освобождаването на ендогенен GLP-1 в контролирано хранене. Плъховете бяха тествани в хирургическа фитнес задача 10 минути след инжектирането. Търсенето на храна се оценява, тъй като броят на главите на главите се инжектира в камерата за хранене по време на 60-минутна оперативна сесия. 1 и 24 часа след оперативното изследване е измерен приемът на chuf. Всяко лечение е балансирано, като всяко състояние е разделено от 4-дневен период. Локомоторната активност се измерва с помощта на хоризонтални инфрачервени лъчи в операционни камери (Med-Associates, Georgia, VT, USA).

Нокдаун на GLP-1R

За потискане на експресията на GLP-1R в LH е използвана къса финална РНК (shRNA), насочена към GLP-1R транскрипти (вж. Schimdt et al. 24 за подробности). Предварителните in vitro проучвания показват - 88% нокдаун на експресията на GLP-1R в клетъчна линия на неврони на плъхове, трансфектирани с тази shRNA. За да потисне експресията на GLP-1R in vivo, тази shRNA последователност беше клонирана и пакетирана в аденоасоцииран вирус (AAV) (серотип 1; титър = 5.22e12) в сътрудничество с ядрото на вируса в Университета на Пенсилвания. Показано е, че тази конструкция намалява експресията на GLP-1R in vivo при плъх VTA с 50%. Зеленият флуоресцентен протеин (GFP), изразяващ AAV (титър = 5.0e12) беше използван като контрола.

За да се определи функционалното значение на ендогенната GLP-1R сигнализация при LH, плъховете са имплантирани хирургически с LH ориентирана водеща канюла, както е описано по-горе. След като плъховете постигнат стабилно поведение, мотивирано от захароза (на 9 седмична възраст), експресиращи AAV GFP (AAV-GFP) или GLP-1R shRNA (AAV-GLP-1R-shRNA) се прилагат двустранно на LH (0,5 μl на полукълбо за 5 минути). Микроинжекторите се оставят на място за 10 минути след инфузията, за да се позволи дифузия далеч от мястото на инжектиране. Плъховете, избрани за всяка лекувана група, бяха коригирани спрямо телесното тегло, приема на храна и параметрите на стимулиране на храната в PR.

Телесното тегло и приема на храна се измерват ежедневно след вливане на AAV конструкцията, с изключение на дните, когато се прилага гладно или ограничаване на храната. Мотивацията за прилагане на захароза се определя, като се използва PR схема 3, 7 и 10 дни след инжектиране на AAV. На 7-ми ден плъхове се гладуват цяла нощ, за да се определи дали приносът на LH GLP-1R сигнализирането към мотивираното от храната поведение се е променил на гладно.

Три седмици след вирусните инжекции са проведени два експеримента, които изискват ограничаване на храната: измерване на кръвната захар на гладно, последвано от орален тест за толерантност към глюкоза (интраперитонеален тест за толерантност към глюкоза; вижте допълнителната информация за подробности) и експеримент на гладно/хранене.

Четири седмици след инжектирането на AAV мастната тъкан се претегля и мозъците се отстраняват. Мозъците бяха дисектирани и LH, NAc и NTS бяха събрани, за да се оцени експресията на GLP-1R чрез количествена PCR в реално време (вж. Допълнителната информация за подробности). От всеки мозък беше взета коронарна секция, съдържаща LH (10 μm), за да се провери правилното местоположение на инжекциите на AAV чрез визуализиране на GFP флуоресценция (представително местоположение е показано на фигура 4).

Втора по-малка група плъхове (n = 20, 10 мъжки и 10 женски, на възраст 13 седмици) бяха включени след първото проучване, за да се определи дали има полови разлики в ефектите от нокдауна на LH GLP-1R и да се следи дневния прием на храна и телесно тегло без прекъсвания в тестването, което изисква ограничаване през нощта при първата група плъхове. В допълнение, друга група женски плъхове (n = 16) бяха тествани за допълнителна оценка на необходимостта от LH GLP-1R при по-млади жени, чието наддаване на телесно тегло беше по-бързо, отколкото при 13-седмични жени; тези плъхове са били на 9 седмици по време на инфузия на AAV-shRNA.

Мониторинг на вирусен тракт и in situ хибридизация

Инжекциите на субединицата на холерен токсин В и хибридизацията in situ се извършват, както е описано по-горе. 33 За подробности вижте Допълнителната информация.

Ефект на Ex4 или хранене върху експресията на LH ген

Хипоталамусните невронални клетки, обезсмъртени от четири мъжки мишки на възраст 8 седмици, бяха използвани за оценка на ефекта от активирането на GLP-1R върху LH невропептидите в невроните. За да се определи дали гените, за които е установено, че са променени в обезсмъртена хипоталамусна клетъчна линия, също се експресират в LH in vivo и се променят чрез поглъщане на мазнини, храна или захароза, плъховете са изложени на подходяща диета в продължение на 1 час дневно в продължение на 1 седмица. всеки друг ден. Мозъците бяха отстранени и LH беше дисектиран веднага след последното хранене. След това се анализира генната експресия (вж. Допълнителна информация и допълнителна таблица за подробности). Във всяка фуражна група имаше по едно животно, което консумира 11, 12, 13 (Фигури 1f-m). Потискането на приема на храна също беше много ефективно (F (2, 26) = 11, 10; P

решаващо

Острата фармакологична блокада на страничния хипоталамусен (LH) глюкагон-подобен пептид-1 рецептор (GLP-1R) увеличава хранителния тласък, но не и приема на храна. Интра-LH микроинжектирането на GLP-1R антагониста, Exendin 9 (Ex9; 10 μg), увеличава количеството получени награди от захароза ( а, б ) и броя на лостовите преси за възнаграждение ( ° С, д ) в графика на прогресивното съотношение, без промяна в неактивната дейност на ливъридж ( д, е ) при мъжки плъхове. По същия начин това лечение значително увеличава приема на храна (брой влизания в дозатора за храна) при мъжки плъхове ( ж, з ). Нито един от тези параметри не се променя при женски плъхове. Приемът на храна, измерен като 1 ( i, j ) и 24 часа ( к, л ) приемът на храна не се повлиява от никакъв пол. Локомоторната активност също не е била значително променена ( м, н ). Данните са изразени като средно ± sem n = 8-10 (мъжки плъхове: м ) и n = 14 (женски плъхове: е ). * P # P = 0,07.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Хроничното затихване на GLP-1R, насочено към LH, води до повишено наддаване на тегло, прием на храна и тласък на храната

За да се определи дали ендогенната GLP-1R сигнализация в LH е необходима за контрол на теглото, прием на храна и мотивация за стимулиране на храната, AAV-GFP или AAV-GLP-1R-shRNA са били прилагани двустранно директно на LH. Това доведе до приблизително 50% и 80% намаления (мъже/по-млади жени и възрастни жени) в експресията на GLP-1R транскрипт при плъхове, заразени с AAV-GLP-1R-shRNA, в сравнение с контролите (Фигура 4n, Допълнителни фигури S8A). и Б). Това лечение беше достатъчно, за да наруши нормалното телесно тегло и хранителната регулация при 9-седмични мъжки плъхове, тъй като плъховете AAV-GLP-1R-shRNA набраха значително повече тегло (F (23, 644) = 10, 69; P

50% при LH плъхове, лекувани с AAV-GLP-1R-shRNA (RNA с къса фиби) в сравнение с контролите ( н ). Коронална мозъчна секция, показваща LH-насочени вливания на контрол и AAV-GLP-1R-shRNA ( относно ). Ядрено оцветяване, DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) е показано в синьо. Панели ( стр а q ) показват зелени флуоресцентни протеинови клетки, експресиращи в LH. * P # P

дискусия

Нашите данни показват, че за разлика от предишни констатации, GLP-1R в мозъка и по-специално в LH са необходими за регулирането на телесното тегло и телесните мазнини при мъжете и жените. По същия начин те са от съществено значение за ограничаване на поведението за възнаграждение с храна при мъжете. Като се имат предвид стабилните и постоянни промени, получени с тази единична генна манипулация в LH, това ядро ​​има огромен потенциал да допринесе както за развитието на затлъстяване, така и вероятно за идентифициране на стратегии за контрол на преяждането.