- абстрактно
- целта:
- дизайн:
- Предмети и методи:
- резултатите:
- заключение:
- Въведение
- Предмети и методи
- елементи
- Експериментален дизайн
- Протокол от теста
- Биохимичен анализ на 25 (OH) D, паратиреоиден хормон (PTH) и калций
- Откриване на активността на теломеразата с помощта на протокол за повторно усилване на теломера
- Статистически анализ
- резултатът
- Серум 25 (OH) D и PBMC реакция на теломераза към добавки с витамин D3
- дискусия
абстрактно
Ние се фокусирахме върху изследването дали добавката с витамин D модулира активността на теломеразата на периферна кръв (PBMC) при афро-американци с наднормено тегло.
дизайн:
Наскоро беше проведено двойно-сляпо, рандомизирано, плацебо-контролирано клинично проучване (# NCT01141192).
Предмети и методи:
Възрастните афроамериканци бяха разпределени на случаен принцип към плацебо групата или групата на витамин D (60 000 IU на месец (съответстващо на ∼ 2 000 IU на ден) добавки с витамин D3 през устата). Пресни PBMC са събрани от 37 пациенти (18 в групата на плацебо и 19 в групата на витамин D), на изходно ниво и след 16 седмици. Активността на PBMC теломераза се измерва, като се използва протокол за теломерно повторно усилване.
резултатите:
Нивата на хидроксивитамин D в серума 25 се повишават от 40,7 ± 15,7 на изходно ниво до 48,1 ± 17,5 nmol 1-1 в най-ранния тест (P = 0,004) в групата на плацебо и от 35,4 ± 11, 3 при изходни стойности от 103, 7 ± 31, 5 nmol 1 –1 при други анализи (P 1, 2, 3, 4 Telomerase е основен ензим, който поддържа дължина на теломерите и потенциал за клетъчна репликация. Устойчивата активност на теломеразата стабилизира дължината на теломерите и забавя/предотвратява стареенето на репликация на Т-клетките.5, 6 Важно е, че повишената активност на теломеразата не само засяга теломерите и пролиферативния потенциал, но също така запазва здравата клетъчна и дългосрочна имунна функция.7, 8 Освен това, данните от модели на мишки показват, че дефицитът на теломераза е свързан с повишен риск от сърдечно-съдови заболявания, 9, 10, 11, 12 нарушава метаболизма на глюкозата и секрецията на инсулин.
Активността на теломеразата, измерена в проби от мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC), е относително нов параметър, който до момента е измерван само в няколко проучвания при хора. Например активността на PBMC теломераза в покой се увеличава при голяма депресия и предсказва антидепресантни реакции. Ниската активност на PBMC теломераза е свързана с повишени сърдечно-съдови рискови фактори при 62 здрави жени, което предполага, че ниската активност на теломеразната левкоцит е ранен маркер на сърдечно-съдовия риск. 15
Последните проучвания сочат благоприятните ефекти на положителните промени в начина на живот върху процеса на стареене на клетките, свързан с разграждането на теломераза/теломераза. Farzaneh-Far et al. 16 наскоро показа, че индивидите в най-ниския квартил на омега-3 мастни киселини (докозахексаенова киселина и ейкозапентаенова киселина) изпитват най-бързото съкращаване на теломерите, докато тези в най-високия квартил имат най-бавното съкращаване на теломерите от 5 години насам. Пионерско цялостно проучване за намеса в начина на живот, проведено от Ornish et al. 17 показват, че активността на PBMC теломераза се увеличава с 29% в края на тримесечна интервенция в начина на живот при 24 пациенти със злокачествен рак на простатата.
Смята се, че витамин D играе важна роля в широк спектър от телесни функции, различни от здравето на костите, включително имунната функция и сърдечно-съдовото здраве. 18, 19, 20 Дефицитът на витамин D, който е често срещан при затлъстелите и афроамериканците, 21 е свързан с различни заболявания, свързани с възрастта, включително хипертония, диабет тип 2, сърдечно-съдови заболявания и смъртност от всички причини. 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26 Наскоро показахме, че добавките с витамин D подобряват сковаността на артериите 27 и ендотелната функция 28 при афроамериканците. Проучване в напречно сечение предполага, че по-високите нива на хидроксивитамин D (25 (OH) D) в серум 25 са свързани с по-дълги дължини на теломерите на левкоцитите при 2160 кавказци. 29 Затова се фокусирахме върху изследването на хипотезата, че добавянето на витамин D повишава теломеразната активност на PBMC при хората.
Предмети и методи
елементи
Общо 70 афро-американски субекта (на възраст 19-50) са докладвани на Института за превенция в Джорджия за скрининг на място. В проучването са включени само привидно здрави афро-американски мъже и жени с анамнеза за сърдечно-съдови, белодробни или метаболитни заболявания. Субектите са били изключени, ако (1) са показали признаци на диабет (хемоглобин А1с - скрининг 6,5%) или стомашно-чревни нарушения/малабсорбция, (2) те са приемали лекарства, за които е известно, че повлияват метаболизма на калция и/или витамин D, (3) са приемали вазоактивни лекарства (4) приемаха витаминни, минерални или билкови добавки, (5) таблетките не можеха да се поглъщат и (6) бяха бременни. От инспектираните 70 субекта, 57 се оказаха допустими и впоследствие бяха рандомизирани за проучването. Всички субекти са предоставили писмено информирано съгласие преди началото на проучването. Протоколът е одобрен от Комитета по правата на човека на Грузинския университет по здравни науки. 28
Експериментален дизайн
Проведено е двойно-сляпо, рандомизирано, плацебо-контролирано клинично изпитване (# NCT01141192). След скрининга всички отговарящи на критериите лица бяха разпределени на случаен принцип към групата на витамин D или групата на плацебо, използвайки аптеката за клинични изследвания на Университета по здравни науки на Грузия. След изходната оценка на всички субекти са прилагани дози под наблюдението на изследовател по време на посещенията им в Института за превенция на Джорджия на всеки 4 седмици в продължение на общо 16 седмици. Дозите са издадени от аптека за клинични изследвания в Университета по здравни науки в Джорджия. За всяко посещение на дозата експерименталната група получава 60 000 IU орална таблетка витамин D3, съответстваща на 2000 IU дневно (Bio-Tech Pharmacal Inc., Fayetteville, AR, USA), докато контролната група получава идентично, очевидно изглеждащо плацебо хапче от това определен производител (микрокристална целулоза, димен силициев диоксид). Доза от 2000 IU на ден витамин D3, по-рано призната за допустима горна граница на прием, не се счита за вредна за здравето. 30
Протокол от теста
Тестовете на изходно ниво и 16 седмици включват антропометрична оценка на височината, теглото и индекса на телесна маса (ИТМ). Кръвното налягане в покой е оценено при всички субекти, като се използват установени протоколи. 31 Общият холестерол, липопротеините с висока плътност, липопротеините с ниска плътност (LDL) и триглицеридите са получени с помощта на инструмент Cardiochek (Polymer Technology Systems, Indianapolis, IN, USA). Гликоцилираният хемоглобин (хемоглобин А1с) се определя с помощта на устройство за грижа за сайта Bayer A1cNow + (Bayer HealthCare LLC, Сънивейл, Калифорния, САЩ).
Биохимичен анализ на 25 (OH) D, паратиреоиден хормон (PTH) и калций
Серум 25 (OH) D, серумен интакт PTH, серумен калций (Ca 2+) и урина Ca 2+ са измерени на изходно ниво и 16 седмици. Концентрациите на серум 25 (OH) D се определят чрез ензимен имуноанализ (Immunodiagnostic Systems, Fountain Hills, AZ, USA) съгласно инструкциите на производителя. Аналитичната надеждност на тестовете 25 (OH) D се наблюдава чрез участие в DEQAS (схема за оценка на външното качество на витамин D) и се счита за приемлива. Коефициентът на вариация (CV) за серум 25 (OH) D е съответно 5,9% и 6,6%. Биоактивният непокътнат PTH се определя в серума от ELISA (Immutopics, Inc., San Clemente, CA, USA), съгласно инструкциите на производителя. Интра-CV CV за серумен ПТХ е 5,7%. Са 2+ в серума и урината се определят с помощта на ColoVetric Calcium Assay Kit BioVision (Biovision, Mountain View, CA, USA) съгласно инструкциите на производителя. Серумните стойности на CV за серумен калций са съответно 5,9% и 6,6%.
Откриване на активността на теломеразата с помощта на протокол за теломерно повторно усилване
PBMCs бяха изолирани от цяла кръв чрез Ficoll-Pague Premium градиентно центрофугиране (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО, САЩ) в рамките на 1 час след вземането на кръв. Изолирани РВМС се съхраняват в криоконсервационна среда, съставена от RPMI-1640, 10% диметил сулфоксид и 10% фетален говежди серум в резервоар за течен азот до по-нататъшна обработка.
Статистически анализ
Ефект на плацебо или витамин D3 за 16 седмици върху 25 хидроксивитамин D (25 (OH) D) (средно ± se). * Значително от изходното ниво.
Изображение в пълен размер
Активността на PBMC теломераза не се различава между изходното ниво. Наблюдавано е значимо взаимодействие между група и време (F 1, 36 = 13, 3; P = 0,001). Активността на PBMC теломераза се е увеличила значително с 19,2% в групата на витамин D от изходно ниво 1,56 ± 0,29 AU до най-ранното 1,86 ± 0,42 AU (F 1, 18 = 20, 0; P
Ефект от 16-седмично добавяне на плацебо или витамин D3 върху активността на PBMC теломераза (средно ± se). * Значително от изходното ниво.
Изображение в пълен размер
Също така открихме значителна корелация между степента на повишаване на активността на теломеразата и нивата на серумния витамин D след лечение при всеки индивид, дори след корекция на възрастта, пола и ИТМ (r = 0,421, P = 0,013).
дискусия
Наскоро извършихме 16-седмично двойно-сляпо, рандомизирано клинично изпитване с добавка на витамин D3, плацебо срещу 60 000 IU на месец (еквивалентно на 2 000 IU на ден) при възрастни афро-американци с наднормено тегло. 28 Основната констатация на това проучване е, че добавките с витамин D3 значително повишават активността на PBMC теломераза с 19,2% по време на 16-седмичната интервенция. Нашите данни показват, че витамин D може да подобри поддържането на теломерите и да предотврати стареенето на клетките.
Доколкото ни е известно, нашето проучване е първото рандомизирано, плацебо контролирано клинично проучване за оценка на ефекта от пероралното добавяне на витамин D3 върху активността на PBMC теломераза при хора, особено афро-американците с наднормено тегло с по-голям риск от дефицит на витамин D и сърдечно-съдови заболявания. Пионерско проучване на Ornish et al. 17 показа, че тримесечната интервенция в начина на живот, включваща хранене и модификация на физическата активност, повишава активността на PBMC теломераза с 29% при 24 пациенти с нисък риск от рак на простатата. Нашето рандомизирано клинично проучване показа, че пероралното добавяне на витамин D3 чрез орално приложение на витамин D3 в доза от 60 000 IU на месец (2000 IU на ден) успява да увеличи афинитета на възрастните американци с наднормено тегло с 19,2%. Нашите открития подкрепят гореспоменатото наблюдение на напречното сечение, че по-високите серумни нива от 25 (OH) D са свързани с по-голяма дължина на левкоцитната теломера 29, което може да бъде постигнато чрез повишена активност на теломеразата. Антиклетъчната функция на стареенето на витамин D може да се дължи на неговите противовъзпалителни ефекти, ефектите на антиоксидантния стрес 32, 33, 34 или чрез негеномно активиране на пътя на оцеляване VDR/PI3K/Akt. 35, 36, 37, 38
PBMCs са критични компоненти на имунната система, участващи в цитотоксичността и производството на цитокини и хемокини. Активността на теломеразата е важен определящ фактор за дължината на теломерите и може да бъде по-ранен предиктор за дългосрочната жизнеспособност на клетките или геномната стабилност от дължината на теломерите. Увеличаването на активността на теломеразата не само засяга теломерите и пролиферативния потенциал, но също така поддържа здрави клетъчни функции и дългосрочна имунна функция. 7, 8 Нови доказателства показват, че теломеразата допринася за клетъчната физиология независимо от способността й да удължава теломерите. Теломеразата насърчава пролиферацията на покойни стволови клетки, 39 действа като транскрипционен коактиватор при Wnt сигнализиране, 40 и регулира митохондриалната функция. 41 Теломеразата осигурява клетъчна защита, особено във връзка с по-къси теломери. 42 Затлъстелите индивиди са склонни да имат по-къси теломери. 1, 2, 3, 4 Увеличението на активността на PBMC теломераза, показано в нашето проучване, предполага, че добавянето на витамин D може да помогне да се противодейства на ускоряването на стареенето на имунните клетки, предизвикано от затлъстяването, и да подобри функцията на имунните клетки.
Витамин D има имуномодулиращи ефекти върху широк спектър от имунни клетки, включително CD4 + и CD8 + лимфоцити, В лимфоцити, макрофаги, както и дендритни клетки, които са основни компоненти на PBMC. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 Няколко in vitro проучвания разкриват, че 1,25 (OH) 2D3 увеличава процента на регулаторните CD4 + Т клетки, 44, 45, 46 и може да намали процента на CD8 + Т клетки. 47 Освен това има разлики в динамиката на теломеразата между CD4 и CD8 Т клетки. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 Следователно не можем да изключим възможността нарастването на активността на PBMC теломераза, индуцирано от витамин D се дължи на увеличаване на някои клетъчни типове в PBMC с по-висока активност на теломеразата, тъй като не сме класифицирали PBMC подтиповете по време на събирането и измерването на теломеразата. Бъдещите проучвания за изясняване на проблема са оправдани.
Доказано е, че добавките с витамин D имат много положителни ползи за здравето, включително здравето на сърдечно-съдовата система. 49, 50 Наскоро извършихме две 16-седмични рандомизирани клинични проучвания, допълнени с 2000 IU витамин D3 дневно и демонстрирахме подобрена артериална скованост при афро-американски юноши, 27 и подобрена ендотелна функция при възрастни с наднормено тегло при афро-американци. Тези резултати предполагат, че витамин D може да забави процеса на съдово стареене. Наскоро Jaskelioff et al. 51 са показали, че при стари мишки с дефицит на теломераза реактивирането на теломераза може да обърне дегенерацията на тъканите. Ефектът на витамин D върху стареенето на клетките при афро-американците с наднормено тегло, демонстриран в това проучване, допринася за нарастващия списък на положителните ефекти на витамин D.
Наблюдавахме значителна разлика в нивата на LDL между плацебо и групата на витамин D в началото. Ние признаваме, че високият LDL може да повлияе на активността на левкоцитната теломераза в по-малка степен чрез увеличаване на количеството на окисления LDL в серума, като по този начин влияе върху клетъчния растеж и производството на цитокини. Цирпанлис и др. 52 установи обратна корелация между активността на окисления LDL и PBMC теломераза при пациенти на хемодиализа (средна възраст 51 години), живеещи в Атина, Гърция. Въпреки това, в нашата млада и сравнително здрава популация от афро-американски проучвания, ние не открихме значителна връзка между LDL активността и теломеразата както в началото, така и след лечението. По-нататъшното адаптиране на LDL заедно с възрастта, пола и ИТМ не променя резултата.
Основните силни страни на това проучване включват: (1) рандомизирано, двойно-сляпо, плацебо-контролирано клинично изпитване може да преодолее объркващия проблем, който съществува в наблюдателни проучвания; (2) 100% съответствие, постигнато чрез контролирано от изследователите дозиране, помага за преодоляване на голям недостатък в клиничните изпитвания.
Ограниченията и притесненията обаче са забележителни. Първо, размерът на извадката от това проучване е сравнително малък. Следователно нашите открития оправдават репликацията в по-голямо проучване. Второ, нашите резултати са наблюдавани след 16-седмично добавяне, необходими са дългосрочни клинични проучвания (например 12 месеца), за да се демонстрира устойчивостта на ефектите от добавянето на витамин D3 върху активността на теломеразата и дължината на теломерите. Трето, по време на вземането на пробите не класифицирахме подвидовете PBMC. Следователно не можем да изключим възможността индуцираното от витамин D повишаване на активността на PBMC теломераза да се дължи на увеличаване на някои видове клетки в PBMC с по-висока активност на теломеразата. Четвърто, необходимо е да се определи дали нашите данни, получени при възрастни афро-американци, са обобщими за друга популация. И накрая, необходимо е да се проучат допълнително основните клетъчни механизми на нашите открития.
И накрая, за първи път демонстрирахме, че добавянето на витамин D повишава активността на PBMC теломераза при афро-американците с наднормено тегло, което предполага, че витамин D може да има антиклетъчно стареене. Необходими са обширни независими клинични проучвания с дългосрочни добавки с витамин D в различни дози и при различни расови/етнически групи.