обезогенният

  • елементи
  • абстрактно
  • Заден план:
  • целта:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Въведение
  • Материали и методи
  • Животни и диета
  • Прием на храна, наддаване на тегло и орален тест за глюкозен толеранс
  • Събиране на тъкани
  • Експресия на хипоталамусен ген
  • Анализ на концентрацията на фолиева киселина
  • Хипоталамусен глобален анализ на метилирането на ДНК
  • Статистически анализи
  • резултатът
  • Прием на храна, наддаване на тегло и отговор на глюкоза
  • Експресия на хипоталамусен ген
  • Състояние на фолиевата киселина
  • Глобално състояние на метилиране
  • дискусия

елементи

  • Генната експресия
  • хипоталамус
  • Хранителни добавки
  • Затлъстяване

абстрактно

Заден план:

Силно мултивитамини (10 пъти AIN-93G, HV), хранени по време на бременност на плъхове Wistar, увеличават характеристиките на метаболитния синдром при потомството, когато се отбият от препоръчаната витаминна (RV) диета.

За да се определи дали ефектите от гестационното хранене на HV върху обезогенните фенотипове при потомството се дължат на променен хипоталамусен контрол на поведението при хранене и дали повишеният им прием на храна може да бъде предотвратен чрез храненето им с високо съдържание на фолиева киселина или диети с високо съдържание на фолиева киселина (10 пъти фолиева киселина, HFol).

методи:

Потомството на мъжете, хранени с диета с HV по време на бременност, отбито от диета с RV, HV или HFol, е сравнено с родените от майките с RV и отбито от диетата с RV за 29 седмици. Приемът на храна за 72 часа и телесното тегло се измерват съответно два пъти седмично и седмично. Глюкозният отговор на глюкозната доза е измерен 18 седмици след отбиването. Хипоталамусна генна експресия на свързани с храненето невропептиди, включително невропептид Y, проопиомеланокортин (POMC), инсулинов рецептор, лептинов рецептор, мозъчен невротрофичен фактор (BDNF), допаминови рецептори (DopaR1/2/5) и серотонин (2A)), както и тъй като глобалното метилиране на ДНК и концентрациите на фолиева киселина в мозъка и плазмата бяха измерени 29 седмици след отбиването.

резултатите:

Храненето на кученце HV или HFol повишава концентрациите на фолати в мозъка и плазмата и предотвратява увеличаването на приема на храна (5%, P = 0,03), телесното тегло (8%, P = 0 0006) и глюкозния отговор на натоварването с глюкоза (36%, P = 0,02), открити при тези, които са хранели диета с RV. Експресията на анорексигенни POMC (P = 0,004) и BDNF (P = 0,02) е по-висока и DopaR1 е по-ниска (P = 0,06) при малките, хранени с HV диета. Диетата за кученца HFol частично доведе BDNF до контролното ниво (P = 0,02) и намали SeroR2A (P = 0,008). Експресията на други гени не е засегната. Глобалното метилиране на ДНК е подобно между диетичните групи.

заключение:

Обезогенният фенотип при потомството от гнезда, хранени с HV, се предотвратява чрез хранене на фураж за HV или HFol, вероятно поради последваща модулация на регулаторните механизми на приема на храна след отбиването.

Диетата, консумирана по време на бременност и ранен постнатален живот, формира траекторията на развитие на потомството. 1, 2 Въпреки че витамините допринасят за всички етапи на развитие, 3 ефектите от консумацията на мултивитамини над изискванията (но на нетоксични нива) по време на бременност като детерминанти на физиологичните фенотипове на потомството са получили малко внимание. Наскоро показахме, че храненето на диета, съдържаща 10 пъти препоръчаното съдържание на мултивитамини (високо мултивитамини (HV)) на плъхове Wistar по време на бременност, води до повишен прием на храна, затлъстяване и метаболитен синдром при възрастни мъже от 4 и 5 жени. отбит от препоръчаната витаминна (RV) диета. Тъй като хипоталамусът е важен регулатор на приема на храна и контрол на апетита 6, може да се приеме, че диетата с високо съдържание на алкохол променя развитието на захранващите невроцити в потомството, което води до обезогенен фенотип. Неправилната регулация на диетичните пътища може да повлияе на растежа и метаболизма, което от своя страна води до развитието на метаболитен синдром по-късно в живота. 7, 8

Материали и методи

Животни и диета

Схематичен чертеж на изследването а ) дизайн a б ) протокол за мъжко потомство от 0 до 29 седмици след отбиването. Диетични съкращения: RV, AIN-93G диета с препоръчани витамини; HV, 10 пъти количеството на препоръчителната мултивитаминна смес; HFol, RV + 10-кратно съдържание на фолиева киселина. Диети, консумирани по време на бременност, маркирани пред линията. Диети, консумирани от потомство, маркирани зад линия.

Изображение в пълен размер

Прием на храна, наддаване на тегло и орален тест за глюкозен толеранс

Фигура 1b показва протокола за изследване. Приемът на храна за 72 часа се измерва на всеки 2 седмици от 0 до 29 седмици след отбиването. Теглото на тялото се измерва при раждането и отбиването, а наддаването на тегло се изчислява седмично от 0 до 29 седмици след отбиването. Отговорът на глюкозата към глюкозната сонда (0,375 g глюкоза на ml, 5 g глюкоза на kg телесно тегло) е измерен 18 седмици след отбиването. Плъховете се гладуват цяла нощ в продължение на 10 часа преди глюкозната сонда. Взема се кръвна проба от опашната вена и изходната глюкоза веднага се анализира, използвайки търговски глюкомер (MediSense Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA). След прилагане на глюкоза, концентрациите на глюкоза в кръвта се определят 15 и 60 минути по-късно и се изчислява нарастващата площ под кривата.

Събиране на тъкани

Мозъците на цели плъхове бяха бързо отстранени след обезглавяване 29 седмици след отбиването и незабавно замразени върху сух лед и след това съхранявани при -80 ° С. Мозъците бяха размразени върху лед и дясната и лявата страна на хипоталамуса бяха разделени отделно, както е описано по-горе . 14 Оптичен хиазъм е използван за определяне на предния хипоталамус. Това минава през предния комитет, който се използва като хоризонтална граница. Линията между задния хипоталамус и телата на бозайниците се счита за каудална част. Дисектираните хипоталамусни блокове съдържаха ядрата на предопептични, супраоптични, паравентрикуларни, предни, супрахиазматични, дорзомедиални, вентромедиални, дъгови, бозайникови, задни и странични сложни ядра. Дясната страна на хипоталамуса се използва за относителна генна експресия, а лявата страна за статус на метилиране на ДНК. Лявата страна на останалия мозък се използва за измерване на концентрацията на фолиева киселина. Кръвта от труп се събира и центрофугира и към плазмата се добавя 0,5% аскорбинова киселина, за да се предотврати окисляването на фолиева киселина.

Експресия на хипоталамусен ген

Всеки дисектиран хипоталамус се хомогенизира, като се използва хомогенизатор на тъканен руптор (Qiagen Tech., Mississauga, ON, Канада). РНК от хомогенизирани проби беше изолирана с помощта на реагент Trizol и екстракция на хлороформ съгласно протокола на производителя (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) и количествено определена с Nanodrop 1000. cDNA беше синтезирана с помощта на високопроизводителен cDNA архивен комплект в ABI (Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния) САЩ) Gene Amp PCR система 2700.

RT-PCR в реално време се извършва на ABI PRISM 7000 система за откриване на последователност, използвайки анализи Taqman за следните гени, закупени от ABI: невропептид Y (кат. № Rn01410146_m1); про-опиомеланокортин (POMC; кат. № Rn00595020_m1); инсулинов рецептор (кат. номер Rn00567070_m1); рецептор за лептин (кат. номер Rn01433205_m1); мозъчен невротрофичен фактор (BDNF; кат. номер Rn02531967_s1); допаминов рецептор 1 (DopaR1; кат. номер Rn03062203_s1); допаминов рецептор 2 (DopaR2; кат. номер Rn00561126_m1); допаминов рецептор 5 (DopaR5; кат. номер Rn00562768_s1); серотонинов рецептор 1А (SeroR1A; кат. номер Rn00561409_s1); серотонинов рецептор 2А (SeroR2A; кат. номер Rn01468302_m1); серотонинов рецептор 2C (SeroR2C; кат. номер Rn00562748_m1). Условията на цикъла са 50 ° С за 2 минути, 95 ° С за 10 минути, 40 цикъла при 95 ° С за 15 s и 60 ° C за 1 минута. Относителният метод за количествено определяне беше извършен с използване на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (Кат. № Rn99999916_s1) като ендогенен контрол, който беше избран чрез предварително скрининг за най-малкото му вариация. Резултатите бяха изразени като кратна промяна, използвайки метода 2- AATCT 15 и анализирани с помощта на софтуера ABI DataAssist версия 3.0.

Анализ на концентрацията на фолиева киселина

Концентрациите на фолат в плазмата и мозъка се определят чрез микробиологичен анализ на микроплаки, използвайки Lactobacillus casei. 16, 17

Хипоталамусен глобален анализ на метилирането на ДНК

ДНК се изолира, използвайки протокола, описан в DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen Tech.). За определяне на концентрацията бяха осреднени две спектрофотометрични стойности на ДНК проби, които имаха съотношение А 260 към 280 между 1,8 и 2,0 и не съдържаха замърсяване с РНК и протеини.

Глобалният метилиращ статус на хипоталамусната геномна ДНК се определя чрез метода за приемане на метил in vitro, както е описано по-горе. 18, 19 Този анализ включва 3Н-метил-S-аденозилметионин (New England Nuclear, Бостън, Масачузетс, САЩ) като донор на метил, медииран от Sss1 DNA метилтрансфераза (New England Biolabs, Pickering, ON, Канада). Известно е, че капацитетът за приемане на метиловите групи в целия геном е косвено свързан с екзогенното включване на 3Н-метил. Всички проби бяха анализирани два пъти и целият тест беше извършен два пъти. Интра и CV CV са 5%.

Статистически анализи

Ефектите от лечението върху наддаването на тегло и 72-часовия прием на храна бяха анализирани, използвайки процедурата на PROC MIXED модел в SAS (версия 9.2, SAS Institute Inc., Carey, NC, USA), с основна диета, кученца и време фактори. Средствата във всяка времева точка и за експресията на хипоталамусния ген, състоянието на фолат и глюкозния отговор бяха сравнени чрез еднопосочен дисперсионен анализ, използвайки PROC GLM, последван от пост-хок тест на Tukey. Значителни разлики бяха отбелязани за P

Прием на храна след 72 часа мъжки потомство от 0 до 29 седмици след отбиването. Диетични съкращения: RV, AIN-93G диета с препоръчани витамини; HV, 10 пъти количеството на препоръчителната мултивитаминна смес; HFol, RV + 10-кратно съдържание на фолиева киселина. Диети, консумирани по време на бременност, маркирани пред линията. Диети, консумирани от потомство, маркирани зад линия. Диета (P = 0,033), време (P ab Значително различно според PROC MIXED модела за повторно измерване. Стойностите са средни ± sem, n = 12 - 14 на група.

Изображение в пълен размер

Телесно тегло на потомството от 0 до 29 седмици след отбиването. Диетични съкращения: RV, AIN-93G диета с препоръчани витамини; HV, 10 пъти количеството на препоръчителната мултивитаминна смес; HFol, RV + 10-кратно съдържание на фолиева киселина. Диети, консумирани по време на бременност, маркирани пред линията. Диети, консумирани от потомство, маркирани зад линия. Наддаване на тегло: диета (P = 0 0006), време (P ab Значително различно според PROC MIXED модела за повторно измерване. Стойностите са средни ± sem, n = 12 - 14 за група.

Изображение в пълен размер

Отговор на кръвната глюкоза към натоварване с глюкоза (5 g глюкоза на kg телесно тегло) като нарастваща площ под кривата (iAUC) на мъжкото потомство 18 седмици след отбиването. Диетични съкращения: RV, AIN-93G диета с препоръчани витамини; HV, 10 пъти количеството на препоръчителната мултивитаминна смес; HFol, RV + 10-кратно съдържание на фолиева киселина. Диети, консумирани по време на бременност, маркирани пред линията. Диети, консумирани от потомство, маркирани зад линия. ab P = 0,02 чрез еднопосочен дисперсионен анализ, последван от post-hoc тест на Tukey. Стойностите са средни ± sem, n = 8 - 12 на група.

Изображение в пълен размер

Експресия на хипоталамусен ген

Диетата с животни на HV, но не и на HFol, дава експресия на POMC за контрол на нивата при възрастни потомци от майки с HV (P = 0.004) (Фигура 5а). HV кученца с HV диета довеждат експресията на BDNF до контролни нива, но диетата на HFol разцепване само отслабва намаляването на HV-индуцирана експресия (P = 0,02) (Фигура 5а). Само диетата за кученца HFol намалява експресията на SeroR2A в сравнение с HV потомство, отбито от RV малки (P = 0,008) (Фигура 5b). В случай на HV потомство, отбито на HV кученце в сравнение с RV потомство (P = 0,06), се наблюдава тенденция на по-ниска експресия на DopaR1 (Фигура 5b). Бременността или кърмачетата не са имали ефект върху хипоталамусната експресия на други гени.

Експресия на хипоталамусен ген ( а ) невропептид Y (NPY), проопиомеланокортин (POMC), инсулинов рецептор (InsR), лептинов рецептор (LepR) и мозъчен невротрофичен фактор (BNDF) и ( б ) допаминови рецептори (DopaR1/R2)/R5) и серотонинови рецептори (SeroR1A/2A/2C) при мъжки потомци 29 седмици след отбиването. Диетични съкращения: RV, AIN-93G диета с препоръчани витамини; HV, 10 пъти количеството на препоръчителната мултивитаминна смес; HFol, RV + 10-кратно съдържание на фолиева киселина. Диети, консумирани по време на бременност, маркирани пред линията. Диети, консумирани от потомство, маркирани зад линия. ab Значително различен еднопосочен дисперсионен анализ, последван от post-hoc теста на Tukey. Стойностите са средни ± sem, n = 4-7 за група.

Изображение в пълен размер

Състояние на фолиевата киселина

Нивата на фолиева киселина в мозъка (Фигура 6а) и плазмата (Фигура 6b) не са били засегнати от диетата на язовирите, но са били увеличени от HV или HFol на кученце.

Ново наблюдение на нашето проучване е, че хипоталамусните пътища за хранене реагират на съдържанието на витамини в храната след отбиването. Храненето на малките HV възстановява експресията на POMC и BDNF, за да контролира нивата при зрели потомци. Тъй като експресията на тези анорексигенни невропептиди е нормализирана, може да се приеме, че съдържанието на витамини в диетата след отбиването допринася за ремоделирането на хипоталамусната функция както при зрели, така и при развиващи се плъхове. Освен това се наблюдава тенденция на по-ниска експресия на DopaR1 при HV потомство, отбито от HV диета, в сравнение с контролното потомство. В ядрото на вентромедиалното хипоталамус освобождаването на допамин е необходимо за започване на хранене и е положително свързано с броя и продължителността на храненето. 27, 28 Чрез вероятно намаляване на сигнала за допамин, диетата за делене на HV може да осигури известна защита срещу прекомерен прием на храна, причинена от гестационна диета за HV. Въпреки че ние сме първите, които показват, че мозъкът на възрастните реагира на витамини, резултатите ни са оправдани от доклада за хипоталамусните промени в регулаторните гени за прием на храна, дължащи се на взаимодействието на диетите с високо съдържание на мазнини при майките и след отбиването при потомството на мъжете.

Въпреки че е доказано, че фолатът е активен участник в метилтрансферните реакции, 12 гестационни диети не са били засегнати от глобалното метилиране дори след отбиването. Това обаче не е изненадващо, тъй като предишни проучвания съобщават, че ДНК метилирането на гени при липса на откриваема промяна в глобалното метилиране предполага, че епигенетичните промени са специфични за даден сайт. 33 В допълнение, диетите RV, HV и HFol в нашето проучване съдържат големи количества холин, което е друг фактор, влияещ върху метилирането на ДНК, 34, 35 и може сам да има латентно откриване на ефекта на фолиевата киселина върху метилирането. Метаболизмът на холин и други витамини от метиловата група (т.е. фолат, витамин В6 и В12) е тясно свързан. 36

Значителната слабост на изследването е резултат от липсата на измерване на генната експресия на различни етапи на зрялост. Следователно не знаем на кой етап на зреене е имало промяна в хипоталамуса след храна след отбиването. В допълнение към хипоталамусните гени, измерването на гени в области на мозъка, участващи в награда и мотивация, може да допринесе за по-пълно разбиране на цялостното въздействие на диетата върху регулирането на приема на храна. Мишките, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (60% калории от мазнини) след отбиване, показват по-ниска експресия на гена на опиоидните рецептори, който засяга веригите за възнаграждение в вентралната област на тегменталната, ядрото на кубиката и префронталната кора. 37

В заключение, обезогенният фенотип при потомство от гнезда, хранени с HV, може да се дължи на променен хипоталамусен контрол на поведението при хранене, но може да бъде предотвратен чрез хранене на пилета с HV или HFol.