Нови подходи за диагностика на лизозомни заболявания, базирани на определянето на свободни олигозахариди в урината

Резюме:

Диагностиката на лизозомни заболявания изисква силно персонализиран подход, тъй като тези заболявания обхващат широк спектър от наследствени метаболитни нарушения с различни молекулярни основи. В допълнение към традиционните методи, структурният анализ на свободните олигозахариди в урината на пациентите с помощта на MALDI TOF/TOF масспектрометрия се превръща в бърза и обещаваща алтернатива. С този нов диагностичен подход ние точно определихме представителните профили на свободните олигозахариди, съдържащи се в урината, типични за избрани нарушения на метаболизма на гликоконюгатите.

нови

Ключови думи: диагностика, гликогеноза, лизозомни заболявания, MALDI TOF/TOF

* Всички таблици, графики и фигури, които са част от статията, могат да бъдат намерени в прикачения PDF файл в края на изследването.

Въведение

Въпреки предполагаемото предположение, че до 300 000 души в Словакия страдат от редки болести (1), молекулярната природа на тези заболявания е многократно уникална и поради това тяхната диагностика изисква максимално персонализиран подход. Лизозомните нарушения на съхранението (LSD) образуват широка група редки наследствени метаболитни заболявания, в рамките на които ги разделяме на:

А.) нарушения в разцепването и разграждането на гликани и гликопротеини (напр. Алфа- и бета-манозидоза, сиалидоза), гликолипиди (напр. Ганглиозидоза GM1, болест на Гоше и Фабри), гликозаминогликани (напр. MPS I-III) и мукополизахариди (напр. MPS IV), Б.) нарушения в разцепването и разграждането на липидите - сфинголипиди (напр. Niemann Pick тип А или В) и триацилглицериди, В.) нарушения в разграждането на протеини и D.) нарушения на лизозомните транспортни протеини (напр. Муколипидоза III и IV ) (2).

Отделните LSD са придружени от натрупване на неразградени продукти в тъканите и гликоконюгати в урината поради недостатъчна активност на лизозомни разграждащи ензими (хидролази). Някои от тях, напр. свободните олигозахариди (FOS) имат характерен профил, специфичен за заболяването. FOS може да бъде открит чрез бърз, точен и неинвазивен диагностичен метод - тандемна масспектрометрия MALDI-TOF/TOF, който точно определя структурния състав на натрупаните олигозахариди в урината и представлява алтернатива на традиционните скринингови техники като тънкослойна хроматография ( Сравнение на подвижността на FOS, присъстващ в пробата, със стандартна смес от олигозахариди с 1-9 хексозни единици. Този метод е подходящ подход за първоначален скрининг, в случай на граничен, респ. При положителен резултат обаче по-нататъшното характеризиране на наблюдавания профил е от съществено значение. Високопроизводителният анализ на MALDI TOF/TOF е подходящо приложение за разграничаване дали кумулативният FOS произхожда от диетата или е съставен от патологични, специфични метаболити.

LSD заболяванията се характеризират с мултисистемни клинични признаци с продължителна прогресия поради постоянно натрупване на неразграден субстрат. Някои симптоми могат първоначално да изглеждат незначителни, респ. типично за друго или по-често срещано заболяване (напр. повръщане, хипогликемия, хипотония, летаргия, конвулсии, глухота, общ неуспех, психомоторна изостаналост) и може да се появи на всяка възраст, от фетална до сенилна. Комбинираното разпространение на LSD е до 1: 5000 живородени (3) и следователно тяхната ранна и надеждна диагноза е съществен фактор, влияещ върху живота на пациентите и техните семейства. Отделът по гликобиология на Института по химия на Словашката академия на науките в сътрудничество с Центъра за наследствени метаболитни нарушения NÚDCH в Братислава въведе и оптимизира аналитичен метод за профили на свободни олигозахариди в урината, който има висока точност, специфичност, чувствителност и може да бъде използва се в допълнение към първоначалния диагностичен подход.и също в случай на проследяване на ефективността на терапията.

Материал и метод

Проби от урина, взети от пациенти с различни лизозомни заболявания (бета-манозидоза, алфа-манозидоза, различни видове мукополизахаридози, муколипидоза, тип I и II ганглиозидоза, сиалидоза) и гликогеноза II. тип (болест на Помпе), респ. от здрави физиологични субекти като отрицателни контроли, се съхраняват при -20 ° C до обработка. След отстраняване на неразтворимата утайка, разредената урина се лиофилизира и така изсушените проби се дериватизират чрез перметилиране (PerMe) с йодометан в основна NaOH среда, излишъкът от който впоследствие се отстранява чрез екстракция с хлороформ. След изсушаване, приготвените PerMe FOS се разтварят в 50% метанол и се нанасят върху MALDI плака в съотношение 1: 1 с матрица 2,5-дихидроксибензоена киселина. Анализът PerMe FOS беше извършен на тандемен мас спектрометър (UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF, Bruker Daltonics, MA, USA) в режим на рефлекторно положителни йони. Постаналитичната интерпретация на измерените спектри е обработена от софтуера GlycoWorkbench и ProteinScape 3.0.

Резултатите

Характерните профили на урината за 7 избрани LSD са определени чрез анализ на перметилиран FOS. Няколко стандартни свободни олигозахариди бяха наблюдавани във FOS спектрите на контролните проби (здрави контроли), които присъстват сред всички възрастови групи, особено m/z 838,40, 879,43, 1,240,61 и 1 274,62. Специфични FOS, получени от кърмата, са потвърдени в неонаталните спектри на кърмата. Получените резултати от анализи на профила на FOS са в съответствие с данните, публикувани в литературата (4,5).

FOS представителни LSD профили (снимка 1), получени чрез MALDI TOF/TOF анализ на перметилирани олигозахариди, съдържащи се в урината на пациентите, представляват типичен олигозахариден състав в резултат на дисфункция или по-ниска активност на специфични лизозомни хидролази:

Дискусия

Анализът на свободните олигозахариди в урината на 7 референтни проби от пациенти с LSD с помощта на масова спектрометрия (MALDI TOF/TOF) идентифицира структурния състав на наличните олигозахариди. Определянето на точната структура на олигозахаридите във връзка с използваните скринингови техники е ефективен и бърз метод за диагностика на избрани лизозомни заболявания преди последващ молекулярно-генетичен анализ. Неговото предимство, в допълнение към високата чувствителност и точност, се крие в предпоставката за проста автоматизация в 96- и многоямков формат, която може да се използва в случай на скрининг на цялата площ или неонатален.

Профилирането и създаването на референтни бази данни за свободни олигозахариди, съдържащи се в проби от пациенти с тези заболявания, зависи от наличието на проби. Ние характеризираме наличието на специфични свободни олигозахариди в урината на седем генетично потвърдени LSD заболявания, получени от Центъра за наследствени метаболитни нарушения NÚDCH в Братислава. От международни бази данни познаваме няколко други референтни спектъра на LSD, напр. за фукозидоза, аспартилглюкозаминурия, болест на Гоше и други (4,5). Тъй като това са много редки заболявания, възможността за добавяне на референтни профили на FOS е ограничена в зависимост от броя на диагностицираните пациенти с LSD. Например към днешна дата в Словакия няма пациент, страдащ от фукозидоза. Въпреки това, с непрекъснато развиващия се надежден скрининг и ранно откриване на пациенти, ще бъде възможно постепенно да се добавят FOS профили на всички 60 LSD заболявания и да се извърши подробно проучване, което също да обсъди резултатите от FOS профилите в зависимост от възрастта, заболяването прогресия и т.н. Сътрудничеството между лекари и научни лаборатории допринася за проверката и по-задълбоченото изясняване на двусмислените, респ. гранични находки при селективен скрининг за съмнение за ЛСД.

Заключение

Понастоящем тънкослойната хроматография (TLC) е основният и стандартен метод за анализ на свободни олигозахариди в урината в клинични лаборатории. TLC има ограничения в специфичността и чувствителността на анализите и не предоставя структурен анализ на FOS олигозахариди, който често е необходим при диагностицирането на лизозомни заболявания. В поредица от няколко LSD заболявания и контролни проби от урина, ние приложихме методи на масспектрометрия MALDI TOF/TOF и определихме структурите на доминиращите олигозахариди за избрани подтипове. Представеният метод представлява значителна полза при диагностицирането на ЛСД, ускорява процеса на диагностично вземане на решения и понастоящем е достъпен в Словакия за пациенти със съмнение за едно от споменатите лизозомни заболявания.

Конфликт на интереси: Авторите заявяват, че нямат конфликт на интереси, и в същото време честно заявяват, че произведението не е публикувано в друго периодично издание.

Благодарности: Тази работа беше подкрепена от Министерството на здравеопазването на Словашката република в рамките на проекта с регистрационен номер 2019/7-CHÚSAV-4 и грант №. 2/0130/18 Словашка грантова агенция за наука VEGA.

Муколипидоза ML2 (GNPTAB) - натрупване на различни FOS с променливи терминални монозахариди - маноза, галактоза или сиалова киселина се наблюдава в спектъра поради недостатъчна функция на някои лизозомни хидролази, сиалидази, бета-галактозидази или алфа-манозидази, ензими, използващи продукти на GlcNAc-фосфотрансфераза (GNTP).