елементи
абстрактно
Преди повече от 40 години Rothwell, Stock и колеги демонстрираха, че диетите с ниско съдържание на протеини (LP) увеличават енергийните разходи (EE) 1, 2. Последвалата работа от Stock Lab показа, че LP диетите увеличават експресията на гена на Ucp1 както в BAT, така и в WAT 3, което показва, че UCP1-зависимата термогенеза допринася за увеличаване на EE. Наскоро нашата лаборатория осигури ендокринен механизъм, за да обясни тази протеинозависима регулация на ЕЕ, тъй като демонстрирахме, че диетите с LP изискват хормона FGF21 за увеличаване на експресията на ЕЕ и Ucp1 и промяна на приема на храна и наддаване на тегло 4, 5 Тези данни са в съответствие с доказателствата, че фармакологичното лечение на FGF21 действа както в мозъка, така и директно върху мастната тъкан, за да увеличи ЕЕ, да стимулира симпатиковия отток и да увеличи регулацията на термогенните маркери в НДНТ и WAT 6, 7, 8, 9, 10. По този начин, активирането на FGF21-зависимото терморегулиращо сигнализиране е ключов медиатор на метаболитните ефекти на диета с ниско съдържание на протеини.
Докато FGF21 явно засяга EE, степента, до която се изисква UCP1-завишено увеличение на UE1 за метаболитния ефект на FGF21, остава неясна. Някои проучвания предполагат, че FGF21 не изисква UCP1 за увеличаване на EE 11, докато при други проучвания заличаването на UCP1 отслабва ефекта на FGF21 12,13. Като се има предвид, че ограничаването на протеините води до хронично регулиране на ЕЕ и ремоделиране на мастната тъкан 4, изглежда също възможно такива ефекти да променят метаболитния отговор на остър стрес и няколко предишни проучвания предполагат, че FGF21 може да бъде увеличен от стрес на студ 7 14, 15, 16, 17, 18. И накрая, също така е известно, че ограничаването на протеините, в допълнение към приема на EE 19, 20, увеличава приема на храна. По отношение на енергийния баланс този модел е необичаен, тъй като хормоните за енергиен баланс (лептин) обикновено поддържат противоречиви промени в приема на храна и ЕЕ. По този начин изглежда възможно промените в приема на храна и ЕЕ да са взаимосвързани, като или увеличаването на приема на храна е адаптивна реакция на повишената ЕЕ (защита срещу загуба на тегло), или алтернативно увеличаването на ЕЕ е адаптивна реакция на увеличението. в приема на храна (защита срещу наддаване на тегло).
Тук ние описваме поредица от изследвания, насочени към тестване на връзката между приема на храна, разхода на енергия, UCP1 и FGF21, използвайки модел на диетично ограничаване на протеините. В тези проучвания индуцираното от LP увеличение на EE изисква както FGF21, така и UCP1. Въпреки това, въпреки увеличаването на EE, FGF21 и UCP1, ограничаването на протеините няма ефект върху телесната температура или отговора на остър студен стрес. Интересното е, че индуцирана от LP хиперфагия също не е била необходима за повишаване на ЕЕ по време на ограничаване на протеините. Взети заедно, тези данни поддържат модел, в който индуцираният от LP FGF21 води до UCP1-зависимо увеличение на енергийните разходи, за да повлияе на метаболитните, но не и на термогенните крайни точки.
резултатът
LP-индуцирано увеличение на енергийните разходи се появява при термонеутралност и изисква UCP1
Мишките Wildype и Ucp1-KO бяха поставени на контролна и LP диета в продължение на 6 седмици при 28 ° C, като енергийната консумация беше измерена през първите 7 дни (фиг. 1А, В). В съответствие с предишните ни проучвания, LP диетата води до значително увеличение на ЕЕ при мишки от див тип (стр 
Ниското увеличение на протеините в потреблението на енергия изисква UCP1. Мишки от див тип и Ucp1-KO бяха поставени на контролна или LP диета (8/група) при 28 ° C, като енергийните разходи бяха записани през първите 6 дни на диета. Консумация на суров кислород (VO2) след преминаване към контролна или LP диета при мишки от див тип ( A ) и Ucp1-KO ( Б. ). Средна EE ( ° С ), ЕЕ, нормализирано спрямо телесното тегло д ), RER ( Е. ) и дейност ( F ) през 5 и 6 ден от експеримента. * Р
Изтриването на UCP1 увеличава загубата на тегло поради ниското съдържание на протеини, отчасти чрез обръщане на ефекта от ниското съдържание на протеин върху приема на храна. Промяна в телесното тегло ( A ), среден дневен прием на храна Б. ), дебел ( ° С ) и постно вещество ( д ) при мишки от див тип и Ucp1-KO, консумиращи контролна или LP диета (8/група) в продължение на 6 седмици при 28 ° C, * P # P
Ефект на ниско съдържание на протеин върху FGF21 и експресията на чернодробни гени и НДНТ при мишки Ucp1-KO. Тъкани бяха събрани от мишки от див тип и Ucp1-KO след консумация на контролна или LP диета (8/група) в продължение на 6 седмици. FGF21 серумът беше измерен чрез ELISA ( A ), докато експресията на гена на черния дроб Fgf21 ( Б., ° С ) и НДНТ ( д ) се измерва чрез PCR в реално време. * Р + P # P 4, което предполага, че излагането на LP диета може да увеличи метаболитния отговор на остър студен стрес. В допълнение, FGF21 е отделно свързан както с реакция на ограничаване на протеините, така и с реакция на студен стрес и по този начин загубата на FGF21 трябва да облекчи всеки полезен ефект от диетата с LP. За да се тества този въпрос, мишки от див тип и Fgf21-KO бяха поставени на контролна или LP диета в продължение на 10 дни при стайна температура (за повишаване на ЕЕ при WT мишки) и след това бяха подложени на остър студен стрес (6 часа при 4 ° C без храна). ). В съответствие с предишната ни работа, LP диетата доведе до значително намаляване на телесното тегло при WT мишки (стр
Ниското съдържание на протеин, индуцирано от FGF21, повишава ЕЕ, но не променя реакцията на остър студен стрес. Мишките WT и Fgf21-KO бяха поставени на LP диета за 10 дни (10/група) при стайна температура, с промяна в телесното тегло ( A ) и ректална температура ( Б. ) се измерват на всеки два дни. На 10-ия ден храната се отстранява и температурата се намалява до 4 ° C за 6 часа, с ректална температура ( ° С ) и измерване на ЕЕ ( D, E, F ). Суров EE ( Е. ) и ЕЕ са нормализирани спрямо телесното тегло ( F ) за 24 часа преди излагане на студ (23 ° C) и последните 3 часа за излагане на студ (4 ° C). Сивият оттенък в панел D представлява изключените светлини, а синият отразява времето на излагане на студ. * Р
Ефект на диета с ниско съдържание на протеини и делеция на FGF21 върху метаболитни крайни точки след остър студен стрес. WT и Fgf21 -KO мишки бяха поставени на LP за 10 дни и на 10 ден храната беше отстранена и температурата беше намалена до 4 ° C. Мишките бяха умъртвени след 6 часа при 4 ° C и беше измерен серумен FGF21 ( A ), чернодробна Fgf21 иРНК ( Б. ), черен дроб ( ° С ) и НДНТ ( д ) експресия на иРНК. 10/група. * Р
Хиперфагия не е необходима, за да се увеличи ниският разход на протеини. Мишки от див тип бяха поставени на контролна или LP диета ad libitum в продължение на 7 дни или поставени на LP, но хранени ежедневно с контролна група (LPPF), за да се предотврати хиперфагия. Ежедневен прием на храна ( A, Б. ), телесно тегло на ден 0 ( ° С ) и ден 7 ( д ) и промяна на BW в рамките на 7 дни ( Е. ). Некорректиран среден дневен разход на енергия ( F ) и средно за 5 до 7 дни ( G ) и ЕЕ, коригирани спрямо телесното тегло на 7-ми ден ( З. а Аз ). 8 мишки/група. * P # P 1, 2, 19, 21, 22, 23, 24. Скорошна работа от нашата лаборатория и други показва, че ендокринният хормон FGF21 се увеличава чрез ограничаване на протеините и е необходим за тези промени 4, 5, 25, 26, 27, 28, 29. Остават обаче още няколко въпроса относно механизма, по който FGF21 действа в контекста на ограничаване на протеините, и дали тези зависими от FGF21 ефекти върху приема на храна, ЕЕ и телесното тегло се индуцират независимо един от друг или са взаимно свързани.
Заедно тези данни доведоха до четири важни заключения. (1) В съответствие с предишната ни работа, LP-диетата увеличава FGF21 и FGF21 е необходим за метаболитните реакции на LP диетата. (2) Индуцираните от LP увеличения на EE изискват UCP1 и загубата на UCP1 обръща ефекта на хранене на LP диетата, (3) Въпреки зависимите от FGF21 увеличения в набирането на EE и UCP1, нито LP диетата, нито FGF21 заличаването влияят на адаптивния отговор на остър студен стрес и накрая (4) индукция на ЕЕ изглежда е основният адаптационен отговор на ограничаването на протеините, докато увеличаването на общия прием на храна изглежда вторично спрямо увеличаването на ЕЕ. Като такива, тези данни поддържат модел, при който FGF21, индуциран от LP, контролира енергийната зависимост на UCP1, като по този начин засяга метаболитните, но не и термогенните крайни точки.
Материали и методи
Животни и диети
Експериментален дизайн
Експеримент 1: Ефект на ограничаване на протеина върху Ucpl-дефицитни мишки, настанени в термонеутралност
Мъжки мишки от див тип и Ucp1-KO (
3 месечна възраст) бяха поставени на контролна или LP диета за 6 седмици (8 мишки/диета/генотип) и поставени при 28 ° C през целия период на изследване. Първоначалната диета се извършва в метаболитни камери (Oxymax, Columbus Instruments), след 1 седмица животните са преместени в стандартно настаняване. Мишките остават на диета в продължение на 6 седмици, като телесното тегло и приема на храна се измерват ежеседмично. Съставът на тялото беше измерен чрез TD-NMR (Bruker Minispec) в началото на експерименталната диета (ден 0), последния ден от метаболитния анализ на OxyMax (ден 7) и в деня на жертвата (ден 42).
Експеримент 2: Ефект на ограничаване на протеините и студен стрес при мишки с дефицит на Fgf21
Мъжки мишки от див тип и Fgf21-KO бяха включени в проучването на приблизително 3-месечна възраст и поставени при стайна температура (23 ° C), поставени на контролна или LP диета за 10 дни (10 мишки/диета/генотип) и храна. прием, телесно тегло и ректална температура, регистрирани на всеки 2 дни. На 9-ия ден половината от мишките от всяка група бяха поставени в метаболитни камери, за да запишат EE на изходно ниво при 23 ° C. На 10-ия ден температурата на задържане за всички мишки беше намалена до 4 ° C за 6 часа, започвайки в 11:00, с EE, регистриран при мишки в метаболитни камери и ректални температури са регистрирани на всеки 30 минути за останалите мишки. След 6 часа мишките се умъртвяват и се събират тъкани, както е описано по-горе.
Експеримент 3: Ефект от сдвояването върху индуцираното от LP увеличаване на енергийните разходи при мишки от див тип
На 3-месечна възраст мъжки мишки от див тип бяха разделени на случаен принцип в три групи за лечение и хранени с контролна или LP диета ad libitum, или хранени с LP диета, но хранени ежедневно с контролна група (за да се избегне хиперфагия, предизвикана от LP) . ). Мишките са били хранени с тези диети в продължение на 7 дни през целия експеримент в метаболитни камери (23 ° C), за да оценят промените в енергийните разходи. Приемът на храна се измерва ежедневно с телесно тегло и състав, измерени в началото (ден 0) и в края (ден 7) на експеримента.
Определяне на FGF21 имуноанализ
Концентрациите на серумен FGF21 се определят при мишки чрез ELISA съгласно препоръчаната от производителя процедура (No. RD291108200R, FGF-21 ELISA при мишки и плъхове, BioVendor). Минималната откриваема концентрация на FGF21 с този анализ е 18,4 pg/ml. За определяне на серумен FGF21, 50 μl серум се разрежда в 200 μl буфер за разреждане преди анализ.
PCR в реално време
Екстракцията на РНК и PCR в реално време се извършват, както е описано по-горе 42. Общата РНК се извлича от черен дроб, iWAT и BAT, като се използва реагент TRIzol съгласно протокола на производителя (Invitrogen), с добавяне на комплект за анализ на тъкани RNeasy Lipid (Qiagen) за BAT & iWAT. Чистотата и количеството на РНК се определят спектрофотометрично, като се използва NanoDrop (Thermo Scientific). Синтезът на CDNA се извършва с iScript (BioRad) и mRNA се определя количествено на платформа ABI 7900, използвайки ABI SYBR Green PCR Master Mix в 384-ямкови оптични плаки (Applied Biosystems). Двойките грундове са проектирани с помощта на инструмента за IDT RealTime qPCR Primer Design с поне един грунд, преминаващ границата екзон-екзон. Експресията на целевия ген се нормализира с циклофилин като ендогенен контрол. Използваните праймери са както следва, написани от 5 ′ до 3 ′:
Fas pre GGGATCTGGTGAAAGCTGTAG; Rev GTGTTCTCGTTCCAGGATCTG
Scd-1 За CTGTACGGGATCATACTGGTTC; Rev CGTGCCTTGTAAGTTCTGTG
Srebp1 За AGATTGTGGAGCTCAAAGACC; Rev CACTTCGTAGGGTCAGGTTC
Klb Pre CAGGGATATCTACATCACAGCC; Rev GTAGCCTTTGATTTTGACCTTGTC
Fgf21 За CAAATCCTGGGTGTCAAAGC; Rev CATGGGCTTCAGACTGGTAC
Fgfr1 За AAAGATCTGGTATCCTGTGCC; Rev TCGAGCTAAGCCAAAGTCTG
Fgfr4 За TGTCAAATTCCGCTGTCCAG; Rev ACCACACTTTCCATCACCAG
Cyc Pre CTTCGAGC TGTTTGCAGACAAAGT; Rev AGATGCCAGGACCTGTATGCT.
Статистически анализ
Данните бяха анализирани с помощта на софтуерен пакет SAS (SAS V9, SAS Institute), използвайки еднопосочни, двупосочни или повтарящи се ANOVA мерки, използвайки обща процедура на линеен модел. Когато експерименталните широкомащабни тестове бяха значими, бяха извършени сравнения post hoc, използвайки изявлението LSMEANS с опцията PDIFF и представляваха най-малко значимите разлики в тестовете за предварително планирани сравнения. Всички данни са изразени като средна стойност ± SEM, с вероятност от 0,05, считана за статистически значима.
Наличност на данни
Файлове с данни, генерирани и/или анализирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответния автор при разумна заявка.
Благодаря
Авторите биха искали Madeleine Dehner, Lexus Trosclair и персонала на PBRC от Comparative Biology Core за тяхната умела помощ и отлична техническа поддръжка. Благодарим и на Dr. Томас Гетис и неговата лаборатория за мишки Ucp1-KO и за полезни дискусии по време на подготовката на този ръкопис. Тази работа беше подкрепена от NIH R01DK081563 и R01DK105032 на CDM. CMH се поддържа от административното приложение NIH R01DK105032-01A1S1. TL беше подкрепен от изследователски престой в Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) LA 3042/2-1. HRB се поддържа от R01DK047348 и HM се поддържа от R01DK092587. Този проект/работа е използван от съоръжения в рамките на ядрото на метаболизма и поведението на животните, ядрото на геномната и клетъчната биология и ядреното биоизображение в PBRC, които са частично подкрепени от безвъзмездни средства от COBRE Center (P30GM118430) и NORC (P30DK072476) от Националния Институти по здравеопазване.
Коментари
Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.