елементи

абстрактно

Приключването на проекта за човешкия геном и разработването на скрининг за целия геном превърнаха технологията на микрочиповете във важен инструмент за изучаване на генетичните ефекти върху етиологията на психиатричните разстройства 7. Предишни проучвания са установили, че гените в кръвта и мозъчните тъкани имат сходни модели на експресия от 8, 9 и е по-лесно да се измери генната експресия в кръвта, защото тя може да бъде получена с минимална инвазивност. Подходите с микрочипове са широко използвани за изследване на невропсихиатрични разстройства като шизофрения 10, биполярно разстройство 11 и голямо депресивно разстройство (MDD) 12. В допълнение, данните от микрочипове са използвани за намиране на нови гени и пътища, които могат да бъдат свързани с етиологията на психиатричните разстройства. Доколкото ни е известно, микрочиповете не са били използвани за изследване на генната експресия в периферната кръв на пациенти с OCD. В това проучване ние се съсредоточихме върху откриването на гени (mRNA), които бяха диференцирано изразени между пациенти с OCD и здрави контроли, използващи технология на микрочипове. Също така извършихме анализ на обогатяването на генни онтологични (GO) и Киото енциклопедия на пътища на гени и геноми (KEGG), свързани с гени, за да изследваме функциите на диференцирано експресираните иРНК.

резултатът

Различно експресирана иРНК

Използвахме микрочипове за геномна иРНК от мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC) на 30 пациенти с OCD и 30 сдвоени здрави контроли.

Открихме общо 51 диференциално експресирани mRNAs с гъвкава промяна ≥ 1, 5 и честота на фалшиви положителни резултати

периферна

Вулканична графика на промени в профилите на генна експресия на целия геном на мононуклеарни клетки от периферна кръв между пациенти с OCD и здрави контроли. Открити са общо 51 значително диференцирано експресирани иРНК с кратна промяна от ≥1,5 и коригирана на Bonferroni р-стойност

Heatmap top 100 диференцирано експресирани гени, които могат да различават пациенти с OCD и здрави контроли, получени чрез йерархичен клъстер анализ.

Изображение в пълен размер

Функционална анотация

Анализът на функционалното обогатяване на GO показва, че 23 от 51 значително диференцирано експресирани иРНК са обогатени с рибозомни протеини, включително клетъчен протеинов метаболитен процес, ендокринно развитие на панкреаса, вирусна транскрипция, вирусен инфекциозен цикъл, вирусна репродукция, генна експресия, транслация на РНК и транслация. Гените, кодиращи NDUFA4 (NADH дехидрогеназа (убихинон) 1алфа подкомплекс), NDUFA5 и NDUFA1 са значително обогатени в митохондриален електронен трансфер и NADH към убихинон, а гените, кодиращи NDUFA4, COX7C (цитохромен случай, редуктаза) трансмембранен транспорт на водород.

Анализът на KEGG лента 51 на значително диференциално експресирани мРНК също идентифицира 23 мРНК, които са обогатени за рибозома; NDUFA4, NDUFA5, COX7C, NDUFA1 и UQCRB, които са значително обогатени при болестта на Паркинсон, болестта на Алцхаймер, болестта на Хънтингтън и безалкохолната мастна чернодробна болест и COX7C, CACNB4 (калциев канал, зависима от напрежението субединица, B 4 и UQ) са значително обогатено от свиване на сърдечния мускул (Таблица 2).

Маса в пълен размер

PCR валидиране в реално време (qRT-PCR)

За да проверим резултатите от анализа на микрочиповете, избрахме 10 диференцирано експресирани транскрипти на иРНК за валидиране чрез qRT-PCR, а именно RPS3A, RPL34, RPS24, RPL23, RPS7, RPL41, RPL7, RPL26, ZNF721 и COMMD6. Резултатите от qRT-PCR показват, че RPL34 е регулиран надолу според анализ на микрочипове, докато RPS3A, RPS24, RPL23, RPS7, RPL41, RPL7 и RPL26 са регулирани нагоре (Таблица 3). Не е установено, че ZNF721 и COMMD6 са диференцирано изразени между OCD и здрави контроли чрез qRT-PCR (Таблица 3).

Маса в пълен размер

дискусия

Доколкото ни е известно, това е първото проучване, което разкрива диференцирано експресирани гени между пациенти с OCD и здрави контроли, използващи технология на микрочипове иРНК. Открихме 45 mRNAs, които бяха регулирани надолу и 6 mRNAs, които бяха регулирани нагоре при пациенти с OCD.

Предишни проучвания показват, че важни гени, участващи в патофизиологията на OCD, са свързани със серотонин, допамин и глутаматни системи 13, 14, 15; обаче не открихме тези гени в това проучване. Тези разлики могат да бъдат обяснени с различните използвани методи за изследване. В предишни проучвания кандидат-генни подходи 13, 14, 15 са използвани за изследване на свързани с OCD гени, докато микрочипове са използвани за откриване на свързани с OCD гени 16. Анализите на GO и KEGG разкриха 23 диференциално експресирани иРНК, обогатени за термини и пътища, свързани с рибозомния протеин (RP).

Рибозомите са субклетъчни органели, съставени от две различни субединици 17 и всяка субединица съдържа различен брой рибозомна РНК (rRNA) и RP. Големите 60S рибозомни субединици се сглобяват с малки 40S субединици, за да образуват 80S рибозоми. При бозайниците 80S рибозомният нуклеопротеинов комплекс съдържа 4 рРНК и приблизително 80 протеина, с повече от 150 свързани протеини и приблизително 70 малки ядрени РНК 18. Малката 40S субединица посредничи при взаимодействията между тРНК и иРНК и избира правилната тРНК за декодиращия център. Голямата субединица 60S съдържа пептидил трансферазен център и осигурява изходен тунел за нарастващата зараждаща се полипептидна верига. Функцията на рибозомите при транслацията на иРНК в протеини и транслацията е силно зависима от рибозомните (RP) протеини19. RPs са силно запазени, така че количествените дефицити водят до намален протеинов синтез 20, който може да повлияе на различни патологични процеси, като рак 21, генетично заболяване 22 и вирусна инфекция 23. .

Членовете на семейството на протеин на цинков пръст (ZNF) имат мотиви за свързване на ДНК и РНК, а аминокиселините са събрани в една структурна единица около цинковия атом 32. ZNF протеините имат широк спектър от функции, включително ДНК транскрипция и разпознаване 33. ZNF804A е идентифициран като един от най-известните рискови гени, свързани с психиатрични разстройства 34, 35. В това проучване установихме, че ZNF721 иРНК е намалена при пациенти с OCD.

COMMD (домен на метаболизма на мед) протеини, съдържащи протеини (известни също като MURR1) са открити преди около 10 години и досега са известни 10 COMMD протеина. Например те участват в медната хомеостаза, регулирането на транскрипционния фактор NF-κB (ядрен фактор κB) и клетъчната пролиферация 36. COMMD6, повсеместно експресиран малък разтворим протеин и ендогенен NF-кВ инхибитор, свързва ДНК и активира транскрипцията 37, 38. Активирането на NF-кВ е свързано с някои невродегенеративни заболявания като последица от невротоксичната роля на NF-кВ 39. Намаляването на COMMD6 или лечението с друг инхибитор на NF-κB NFκBIA може да увеличи активирането на NF-κB, което може да наруши функцията на хипокампа при лица с OCD.

Субединицата NADH дехидрогеназа (убихинон) 1 алфа подкомплекс (NDUFA4) е 14-та субединица на цитохром с оксидазата. NDUFA4L2 инхибира окислителния фосфорилиращ комплекс I, крайният кислороден комплекс, приемащ ензимния комплекс на митохондриалната дихателна верига, за да медиира преминаването към гликолиза в растящите клетки и раковите тъкани 40. Свръхекспресията на NDUFA4, наблюдавана в белодробните ракови клетки, е в контраст с понижаващата му регулация при болестта на Алцхаймер. Предишно цяло изследване на генома установи, че NDUFA4 е свързан с болестта на Алцхаймер и е идентифициран като потенциален биомаркер на заболяването 41. Убихинол цитохром с редуктаза свързващ протеин (UQCRB) е важен за стабилността на митохондриалния комплекс III, електронен транспорт, клетъчно кислородно засичане и ангиогенеза. NDUFA, COX7C и UQCRB участват в митохондриалната дихателна верига и трите са регулирани надолу при пациенти с OCD. Съществуват обаче ограничени знания за връзката между митохондриалната дисфункция и OCD.

Гени, кодиращи рецептори за горещ вкус тип 2 (TAS2R30 и TAS2R46) бяха регулирани нагоре в OCD. TAS2R се експресират широко извън мозъка, но връзката им с OCD е неизвестна.

CACNB4 е една от захранваните с напрежение субединици на бета канали, за които наскоро беше установено, че функционират при невронална възбудимост и генна транскрипция 42. CACNB4 е свръхекспресиран при шизофрения и е свързан с депресия на калциевите токове, които контролират образуването и стабилизацията на гръбначния мозък, а установено е, че повишената експресия на CACNB4 води до ниска гръбначна загуба 43. Предполага се, че установеното в нашето проучване повишаване на CACNB4 може да е свързано с патогенезата на OCD.

В нашето проучване трябва да се отбележат няколко ограничения. Първо, размерът на пробата е сравнително малък, което може да намали статистическата мощ за сравняване на генната експресия между OCD и здрави контроли. Имаше несъответствия в посоката на генните промени между анализа на микрочипове и валидирането на qRT-PCR, вероятно защото бяха използвани различни проби за валидиране и пациентите бяха на различни етапи на разстройството и в различни режими на лечение.

И накрая, открихме променени модели на генна експресия при пациенти с OCD и подчертахме ролята на RP гените в патогенезата на OCD.

Материали и методи

Профили на участниците

Това проучване е проведено в Центъра за психично здраве на Уси в Медицинския университет в Нанкин, Уси, провинция Дзянсу, Китай. Приети са тридесет пациенти с ОКР и 30 сексуално и възрастово здрави контроли. И в двете групи имаше 20 мъже и 10 жени. Средната възраст е била 28,8 ± 12,0 години (диапазон 15–60 години) и 28,8 ± 11,1 години (диапазон 17–56 години) за пациента и контролната група. Диагнозата на OCD беше потвърдена от структурирано клинично интервю за DSM-IV разстройства (SCID). Пациенти с шизофрения, MDD, коморбидно ос I разстройство или анамнеза за неврологично заболяване бяха изключени. Здравословни прегледи без психиатрични заболявания или сериозно здраве бяха получени от местната общност.

Това проучване е одобрено от Комитета по човешка етика на Центъра за психично здраве на Уси към Медицинския университет в Нанкин. Всеки участник предостави писмено информирано съгласие. Всички учебни процедури бяха в съответствие с Декларацията от Хелзинки от 1975 г.

Вземане на кръвни проби и изолиране на PBMC

Периферната кръв се събира в 10 ml вакуунерни епруветки, съдържащи EDTA, и веднага се съхранява при 4 ° C. Цялата кръв се обработва в рамките на 2 часа след събирането.

Центрофугирането с градиент на плътност на Ficoll се използва за разделяне на мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC). Накратко, разредената с физиологичен разтвор кръв се наслоява през Ficoll, след което се центрофугира, за да се отделят червените кръвни клетки, PBMC и плазмата. PBMCs се изсмукват внимателно и напълно от слоя Ficoll и се прехвърлят в нова епруветка, която се измива два пъти.

Изолиране на обща РНК

Общата РНК беше извлечена от PBMCs, използвайки реагент TRIzol (Invitrogen, САЩ), съгласно инструкциите на производителя и количествено определена с помощта на NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific). Целостта на РНК (RIN) беше оценена с помощта на Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies).

Средният (SD) RIN за всички проби е 9,29 (0,48). Съотношението 28S към 18S рРНК е 2.79 (0, 35) и RIN е ≥7. За 28S: 18S, RIN стойност> 0.7 се счита за приемлива РНК качество съгласно инструкциите на производителя.

иРНК микрочипове, маркиране, хибридизация и сканиране

Общата РНК бе маркирана с пълна иРНК и Hyb Kit (Agilent Technologies) и хибридизирана с човешка lncRNA Microarray 4, 04 x 180 K (Agilent Technologies). Микрочипът съдържа 30 656 сонди за човешка иРНК, като всички те са получени от авторитетни бази данни, включително RefSeq Build, Ensemble Release, GenBank и Unigene Build. Общата РНК (по 200 ng всяка) беше обратно транскрибирана в двуверижна cDNA, след това синтезирана в cRNA и обозначена с цианин-3-CTP. Белязаните сРНК се хибридизират до микрочип. След измиване чиповете бяха сканирани с помощта на скенер Agilent Microarray (G2505C, Agilent Technologies).

Валидиране чрез qRT-PCR

Обща РНК беше изолирана от PBMC от допълнителни 26 двойки OCD и здрави контроли, използвайки реагент TRIzol (Invitrogen) с обработка на колона DNase I, както е описано от производителя. cDNA беше синтезирана с помощта на висококапацитетен RNA-to-cDNA Kit (Invitrogen) в съответствие с инструкциите на производителя. QRT-PCR се извършват, като се използват праймерите, изброени в таблица 4, и SYBR® Select Master Mix (Invitrogen) на 7900HT PCR машина в реално време (Applied Biosystems, САЩ) със следните цикли: 2 минути при 50 ° C, 2 минути при 95 ° C, след това 40 цикъла от 15 s при 95 ° C, 60 s при 60 ° C, последвано от стандартен протокол за дисоциация, за да се гарантира, че всеки ампликон е отделен продукт. Всички количествени оценки бяха нормализирани в ACTB. QRT-PCR се провеждат в три екземпляра за всяка независима проба.

Маса в пълен размер

Анализ на данни

Софтуерът Agilent Feature Extraction (версия 10.7.1.1; Agilent Technologies) е използван за анализ на изображенията на изображенията за получаване на сурови данни. GeneSpring (GX v11.5.1; софтуерен пакет Agilent Technologies) беше използван за анализ на сурови данни. Първоначално суровите данни се нормализират с помощта на квантилен алгоритъм, последван от анализ на диференциална експресия с помощта на студентски t-тест. За по-нататъшен анализ на данни бяха избрани сонди, които са имали поне 1 от 2 състояния и са имали 75% симптоми в "Р". Диференциално експресирани гени бяха идентифицирани въз основа на промяната в пъти, както и р-стойността, изчислена с помощта на t-теста на студента. Прагът, зададен за регулираните нагоре и надолу гени, е кратна промяна ≥ 1, 5 и честота на фалшиво откриване ≤ 0,05.

Нивата на експресия на MRNA между пациенти с OCD и здрави контроли бяха анализирани с помощта на анализа на Mann-Whitney U.

За да корелираме диференциално експресираните иРНК с биологичните процеси, ние коментирахме иРНК, използвайки GO термини и пътища на KEGG (//www.genome.ad.jp/kegg/), за да определим техните потенциални роли. След това извършихме йерархичен клъстер анализ, за ​​да покажем различими модели на генна експресия между OCD и здрави групи. Колкото по-ниска е стойността на p, толкова по-значима е корелацията; препоръчителната граница на р-стойност е 0,05.

Наличност на данни

Всички данни от микрочипове се съхраняват в Gene Expression Omnibus (GEO) в Националния център за биотехнологична информация на NIH под сериен номер GSE78104.

Благодаря

Искрено благодарим на пациентите и здравите доброволци за участието им, както и на медицинския персонал, участващ в събирането на проби. Тази работа беше подкрепена от Националната научна фондация на Китай (81101008) и Националната научна фондация на провинция Дзянсу (13K2012546).

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.