абстрактно

Въпреки че съвременните терапии могат да бъдат ефективни първоначално, много тумори в крайна сметка стават химиоустойчиви, което води до неуспех на лечението. В резултат на това остава спешна нужда от нови терапевтични подходи за лечение на рак на яйчниците.

Изобразяването и терапията на заболяванията на щитовидната жлеза са възможни поради способността на щитовидната жлеза да натрупва йодид. Това се медиира от символа на натриев йодид (NIS), трансмембранен гликопротеин, експресиран върху базолатералната мембрана на фоликуларните клетки на щитовидната жлеза. Последните разработки в генната терапия доведоха до много изследвания, насочени към въвеждане на експресия на NIS при други видове тумори, за да се осигури образно изследване и терапия с йод с йод. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 Способността за въвеждане на експресия на NIS в тумори на яйчниците би била много полезна. Наред с широко разпространените доказателства в терапията с щитовидната жлеза с радиойодид, NIS предлага голямо предимство като терапевтичен ген, тъй като осигурява образна диагностика, за да потвърди целевата експресия на протеин преди да продължи терапията. Също така, страничният ефект, свързан с употребата на 131 I, означава, че не всички целеви клетки трябва да експресират NIS, за да постигнат пълен терапевтичен ефект. 12

В миналото описахме успешното използване на промотора MUC1 за стимулиране на експресията на NIS за радиойодидно изображение и терапия на ракови клетки на гърдата. Свръхекспресия на MUC1 също е докладвана при повечето тумори на яйчниците, 18, 19, 20, 21, и по този начин тази конструкция има потенциал за приложение в този туморен модел. Това проучване описва въвеждането на експресия на NIS в туморни клетки на яйчниците както in vitro, така и in vivo, последвано от 123 I образна диагностика и 131 I терапия.

Туморите на яйчниците представляват друго предизвикателство за вирус-медиираната генна терапия, тъй като е доказано, че те изразяват променливи нива на молекули, необходими за аденовирусна инфекция, като коксакивирусен рецептор и аденовирусен рецептор (CAR) и интегрини. Следователно, две аденовирусни конструкции, съдържащи NIS под контрола на (1) цитомегаловирус (CMV) или (2) MUC1 промотори са използвани за заразяване на клетъчната линия на рака на яйчниците (OVCAR-3), за която се съобщава, че изразява умерени нива на CAR. Мощният неспецифичен CMV промотор първоначално се използва за определяне дали функционалната експресия на NIS може да бъде определена в този in vivo модел. След успешно лечение на CMV/NIS-трансдуцирани тумори, конструкцията MUC1/NIS се използва за осигуряване на транскрипционно насочване за MUC1-положителни тумори и допълнително за намаляване на риска от екстратуморална токсичност. Това проучване представлява обещаваща първа стъпка, изследваща потенциала за NIS-медиирано радиойодно изобразяване и лечение на тумори на яйчниците.

резултатът

125 I проучвания за усвояване

Способността на OVCAR-3 клетките да абсорбират йодид в различни моменти от време след Ad/CMV/NIS или Ad/MUC1/NIS инфекция беше изследвана in vitro (Фигура 1). Оптимално поемане на йодид се наблюдава 3 дни след инфекцията, с 12-кратно увеличение спрямо контролните клетки, наблюдавано в CMV/NIS трансдуцирани клетки (4226 ± 169 cpm) в сравнение с 5,5-кратно увеличение на MUC1/NIS-трансдуцирани клетки (1898). . ± 23 cpm). Във всички случаи поглъщането на йод е блокирано в присъствието на KCLO4, известен инхибитор на NIS функцията.

радиойодиден

Поглъщане на йод в клетки OVCAR-3 в различни моменти от време след инфекция с аденовирус, съдържащ NIS под контрола на промотори CMV или MUC1 (множественост на инфекцията (MOI) 80). Оптимално поемане на йодид и с двете конструкции се наблюдава 3 дни след вирусна инфекция. Поглъщането на йод се блокира в присъствието на KClO 4, известен инхибитор на NIS функцията.

Изображение в пълен размер

Уестърн петно

Екстракти от мембранни протеини (10 μg) от NIS-трансдуцирани клетки на яйчниковия карцином (OVCAR-3) бяха подложени на Western blot с миши моноклонални антитела срещу аминокиселини 468 до 643 от човешки NIS протеин (Фигура 2). Мембранните екстракти от клетки, заразени с CMV/NIS (Фигура 2а (ii)) и MUC1/NIS (Фигура 2b (ii)), бяха положителни за NIS протеин при очаквания размер от -75-100 kDa. Размерът на NIS протеина зависи от състоянието на гликозилиране и може да варира от 50 до 110 kDa, като 50 kDa представлява негликозилирания протеин. Нивото на имунореактивност, открито в CMV/NIS-трансдуцирани клетки, е по-силно от нивото, наблюдавано, когато NIS е под контрола на промотора MUC1, въпреки че тази клетъчна линия изразява високи нива на MUC1 протеин. Не е открит NIS протеин в клетки, заразени с контролния вирус (Фигура 2а (i) и b (i)), въпреки че са наблюдавани някои слаби неспецифични ленти.

Western blot анализ на експресията на NIS в клетки OVCAR-3 след инфекция. ( а ) (i) Ad5/NIS, (ii) Ad5/CMV/NIS. ( б ) (i) Ad5/NIS, (ii) Ad5/MUC1/NIS. Мембранни екстракти от клетки OVCAR-3, заразени с Ad5/CMV/NIS ( а (ii)) и Ad5/MUC1/NIS ( б (ii)) показа силна имунореактивност срещу миши анти-NIS антитела, разкривайки протеин ∼ 75–100 kDa. И в двата случая експресия на NIS не е открита в мембранни екстракти от клетки, трансфектирани с контролен вирус ( а (i), б (i)).

Изображение в пълен размер

имунохистохимия

NIS-трансдуцираните OVCAR-3 клетки се фиксират в метанол и се подлагат на имунохистохимично оцветяване, за да се определи местоположението на NIS протеина в клетката (Фигура 3). Инфектираните с NIS клетки под контрола на CMV (Фигура 3b) или MUC1 (Фигура 3c) промотори също са положителни за мембранно насочен цитоплазмен NIS протеин. За да функционира NIS протеинът, той трябва да бъде насочен към клетъчната мембрана. Когато е под контрола на CMV промотора, NIS изглежда има подобрено насочване към мембраната, което корелира с увеличените нива на поглъщане на йодид, наблюдавани на Фигура 1. Клетките, заразени с вирус без промотора, са отрицателни за NIS имунореактивност (Фигура 3а).

Имунохистохимичен анализ на експресията на NIS в клетки OVCAR-3 след инфекция ( а ) контролен вирус, ( б ) Ad5-CMV-NIS или ( ° С ) Ad5-MUC1-NIS. В NIS-трансдуцираните клетки се открива имунореактивност както към мембранната, така и към цитоплазмената NIS имунореактивност. Заразени с вируси клетки без промотор ( а ) са били отрицателни за NIS имунореактивност.

Изображение в пълен размер

In vivo 123 I изображения

In vivo изобразяване на OVCAR-3 тумори на три мишки с помощта на гама камера след приложение на 0,5 mCi 123 I. 3 дни преди приложението на йодид, на мишките се правят интратуморални инжекции на Ad/CMV/NIS, Ad/MUC1/NIS или контролен вирус. И трите изображения показват абсорбция на йодид в щитовидната жлеза и стомаха, които изразяват NIS, както и в пикочния мехур, където йодидът се екскретира с урината. Снимка ( а ) също така показва ясен образ на тумор, който е бил заразен с Ad/CMV/NIS на левия фланг, с по-малко интензивно изображение на тумора, очевидно при животно, инжектирано с конструкцията MUC1/NIS ( б ). В панела ( ° С ), където левият тумор е заразен с контролен вирус, няма туморно изображение.

Изображение в пълен размер

131 I терапия

Мишките получиха интратуморална инжекция от 5 х 108 PFU Ad/CMV/NIS, Ad/MUC1/NIS или Ad/CMV, 3 дни по-късно интраперитонеална доза от 3mCi 131I или физиологичен разтвор. След това размерът на тумора (Д × Ш × В × 0,51) се измерва ежеседмично с помощта на шублери (Фигура 5).

In vivo терапия с радиойод на OVCAR-3 ксенографи на тумори на яйчниците. Туморите са заразени с Ad5/CMV/NIS, Ad5/MUC1/NIS или контролен вирус (пунктирана линия), последвано от интраперитонеална доза от 131 L или физиологичен разтвор. Статистическият анализ беше извършен с помощта на t-тест на Student, с P = 0,05, считан за статистически значим. Ad5/CMV/NIS + 131 I спрямо Ad/CMV/NIS - 131 I, P 131 I в сравнение с Ad5/CMV (без NIS) + 131 I, P 131 I, постепенно намален по размер до 131 I, нараства драстично до средното обем 268 ± 35 и 332 ± 154% от изходния обем (P 15, 28 е първото проучване, в което се докладва медиирана от NIS 131 I терапия на тумори на яйчниците в животински модел.

Въпреки че тези предварителни резултати са донякъде обещаващи за използването на медиирана от NIS терапия за тумори на яйчниците, липсата на специфичност, предоставена от промотора на CMV, може да бъде проблематична. Повечето видове рак на яйчниците се откриват едва след метастази и по този начин се състоят от няколко разпространени тумора, често ограничени до перитонеалната кухина. Следователно интраперитонеалното приложение на вируса е привлекателен начин за лечение на това заболяване, за да се увеличи взаимодействието между вируса и туморните клетки, което обаче поражда загриженост относно селективността. Неинвазивно радиойодидно изображение може да се извърши, за да се потвърди правилната локализация на НИС преди продължаване на терапията. Обаче, транскрипционното насочване на експресията на NIS може потенциално да увеличи дозата на вируса към целевите клетки и да избегне токсичност за черния дроб и нормалните мезотелиални клетки.

Наскоро описахме пълна туморна регресия след лечение на Ad5/MUC1/NIS ксенотрансплантати на рак на гърдата при мишки. По-голямата част от туморите на яйчниците също се съобщават за свръхекспресия на MUC1, 18, 19, 20, 21, докато нормалните мезотелиални клетки са слабо или изобщо не се експресират. 29 След успеха на конструкцията CMV/NIS, използвахме Ad/MUC1/NIS, за да осигурим транскрипционно насочване за тумори и да сведем до минимум потенциалните ефекти върху околните нормални клетки. В настоящия модел, въпреки факта, че OVCAR-3 клетките експресират стабилния MUC1 протеин, 18-те нива на експресия на NIS не са били достатъчно високи, за да предизвикат регресия на тумора след терапия с 131 I. Това може да се дължи на намалена ефективност на инфекцията в сравнение с гърдата модел на рак. Изображенията на 123I показват ограничено поемане на йодид в мястото на тумора. Въпреки това, в 8-седмичния период от време, обемът на тумора е значително по-малък след MUC1/NIS инфекция и 131 I терапия в сравнение с контролните тумори. Това предполага, че с подобрения, които водят до по-високи нива на експресия, това може да бъде жизнеспособен подход за този туморен модел.

Успехът на медиирания от аденовирус генен трансфер зависи от ефективната in vivo трансдукция. Включването на усилващ елемент нагоре от промотора на MUC1 може да увеличи нивото на получена експресия на NIS, но не надвишава субоптималните скорости на трансдукция на тумора. Много групи са демонстрирали подобрена инфекция на яйчникови модели на CAR-изчерпващи яйчници, използвайки CAR-независими или независими от тропизма аденовирусни конструкции, за да заобиколят черния дроб и да се насочат към специфични клетъчни типове, които обикновено не са устойчиви на аденовирусна инфекция. 32, 33, 34, 35. Това може да увеличи вирусния товар в мястото на тумора и да позволи използването на по-ниски вирусни дози, потенциално намалявайки имунния отговор след приложението на вируса.

Представените тук обещаващи предварителни резултати показват радиойодидно изображение и терапия на тумори на яйчниците в комбинация с образуването на модифицирани аденовирусни вектори, което предполага потенциал за медиирана от NIS терапия като нов подход за лечение на рак на яйчниците.

Материали и методи

Клетъчна култура

Клетъчната линия на карцинома на яйчниците OVCAR-3 се поддържа в среда RPMI, допълнена с 10% фетален говежди серум и пеницилин G (2 U/ml)/стрептомицин сулфат (100 mg/ml). Клетките се поддържат при 37 ° С, 5% CO 2 със среда се сменя два пъти седмично и преминаването на всеки 7 дни.

Производство на аденовирус

Конструкт с човешки рекомбинантен аденовирусен серотип 5 с дефицит на репликация, съдържащ човешки NIS под контрола на промотора MUC1 (-1401 до +33), беше приготвен в сътрудничество с ViraQuest Inc. (North Liberty, IA, USA), както е описано по-горе. Накратко, вложката MUC1/NIS беше клонирана във VQ/5k плазмиден вектор, предоставен от ViraQuest, и след това трансфектирана в 293 клетки, съдържащи аденовирусна ДНК, ограничена преди това до отстраняване на част от Е1 региона. След пречистване на плаките, рекомбинантен Ad/MUC1/NIS аденовирус се разширява в 293 клетки и се пречиства чрез свързване на градиенти на плътността на CsCl, последвано от диализа. Друг аденовирус с дефицит на репликация, съдържащ NIS под контрола на неспецифичния промотор на CMV, е бил на склад от предишни експерименти и е генериран по същата техника. 16.

Аденовирусна инфекция на клетки OVCAR-3

Клетките се посяват в 12-ямкови плаки ден преди инфекцията при плътност на засяване 1,5 х 105 клетки/ямка, за да се постигне ∼ 60% сливане за инфекция. След това клетките се измиват и инкубират в среда без серум и към всяка ямка се добавят различни количества вирус. След 3 часа инкубация при 37 ° С, клетките се измиват и инкубират в пълна среда за 72 часа преди NIS експресия/анализ на функцията. Всички аденовирусни инфекции са възникнали поне в три екземпляра.

125 I проучвания за усвояване

Способността на клетките да концентрират йодид се определя, както е описано в Weiss et al. Накратко, след трансфекцията, клетките бяха инкубирани в HBSS, съдържащ 10 mM HEPES, 10 μM NaI и 0,1 μCi Na125I/ml, pH 7, 3 и 10 μM KClO 4, конкурентен инхибитор на поглъщане на йодид от NIS., Беше включен в контролните ямки . След 45-минутна инкубация при 37 ° С, клетките се измиват с ледено охладен с фосфат буфериран физиологичен разтвор (PBS), лизират се с 1 М NaOH и концентрираният йодид се измерва върху γ-колектор.

Екстракция на мембрана

Мембранните протеини бяха извлечени от заразени клетки, като се използва процедурата, описана по-горе. Накратко, клетките се промиват и ресуспендират в буфер А (250 mM захароза, 10 mM HEPES (рН 7,5), 1 mM EDTA, 10 μg/ml левпептин, 2 μg/ml апротинин, 1 mM PMSF). и след това се замразява за една нощ при -20 ° С. Клетъчната суспензия след това се размразява и центрофугира при 500 g в продължение на 15 минути при 4 ° C. Прибавя се 1 ml 1 M Na 2 CO 3 на ml супернатант, последвано от разклащане при 4 След това се центрофугира при 100 000 g в продължение на 15 минути и гранулата се ресуспендира в буфер В (250 тМ захароза, 10 тМ HEPES (рН 7,5), 1 тМ MgCl2). Съдържанието на протеин беше определено с помощта на BioRad DC протеинов анализ (Hercules, CA, USA).

Western blot анализ

За анализ на Western blot е използвана система за електрофореза NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Мембранният протеин от клетъчни линии (10 μg) се редуцира в DTT (0,5 М) в продължение на 10 минути при 70 ° С. След това пробите се обработват върху 4-12% NuPAGE Bis-Tris градиент предварително сглобен полиакриламиден гел за 1 час при 200 V. Аликвотни части от стандарти за молекулно тегло на протеини бяха проведени едновременно на всеки гел за сравняване на размера на пробата. Извършва се електроблотинг в продължение на 1 час при 25 V за прехвърляне на протеинови проби към нитроцелулозна мембрана. За да се предотврати неспецифично свързване, мембраните се инкубират в 5% мляко в TBS-T (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,1% Tween 20) в продължение на 1 час, последвано от промиване в TBS-T. Мембраните бяха инкубирани в миши моноклонални антитела (1: 20 000 в 0,1% мляко), насочени срещу човешки NIS протеин (aa 468-643) 38 в продължение на 1,5 часа и промити в TBS-T. След това белязано с хрян пероксидаза козе анти-мише антитяло (1: 10 000) се добавя към мембраните за 1,5 часа. След етапите на измиване, ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) бяха приложени върху мембраните за 1 минута. След това филмите на Kodak BIOMAX MR бяха изложени на мембраните за около 2 минути.

Имунохистохимичен анализ

Клетките се поставят в двукамерни предметни стъкла с плътност на инокулация 1,5 х 105/добре преди инфекция и имунохистохимия. Слайдовете се поставят върху лед за 15 минути и след това клетките се фиксират в студен метанол при -20 ° С за 15 минути. След отстраняване на метанола, клетките се инкубират в 10% нормален кози серум (NGS), разреден в PBS/0,05% Tween 20 (PBS-T) за 30 минути, за да се блокира неспецифичното свързване. След това се прилага мише моноклонално антитяло (1: 2000), насочено срещу човешки NIS протеин (аа 468-643) 38 за 60 минути, последвано от промиване в PBS-T. След това клетките бяха инкубирани с биотинилиран кози антимиши имуноглобулин (1: 200) в продължение на 20 минути. Клетките се измиват и след това се прилага конюгиран с пероксидаза стрептавидин (1: 300) за 20 минути. След измиване се извършва откриване, като се използва пероксидазен субстратен комплект, съдържащ хромоген диаминобензидин (DAB) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Клетките се оцветяват с малахитово зелено в продължение на 5 минути, преди да се покрият с монтажна среда Dako® Glycergel (Carpintoria, CA, USA).

Растеж на яйчникови ксенотрансплантати при мишки

Голи атимични голи мишки (Harlan Sprague - Dawley, Indianapolis, IN, USA) получиха подкожна инжекция от 1 х 106 OVCAR-3 клетки, суспендирани в 0.2 ml среда RPMI от едната или от двете страни. Когато туморите достигнат подходящия обем (

100 mm 3), мишките бяха поставени на диета с ниско съдържание на йод с вода, допълнена с Т4 (5 mg/L), за да се намали поемането на йод в щитовидната жлеза. Всички експерименти бяха одобрени и проведени в съответствие с насоките на клиниката Mayo (Рочестър, MN, САЩ).

Аденовирусна инфекция на туморни ксенотрансплантати

Мишки с тумори ⩾ 100 mm 3, които се поддържат на диета с ниско йодиране, се инжектират интратуморално с 5 х 10 8 PFU от рекомбинантен Ad5-CMV-NIS, Ad5-MUC1-NIS или контролен вирус в общ обем от 100 μl от 3% захароза/PBS. Туморите се инжектират на множество места, за да се увеличи дисперсията на вируса с помощта на инсулинови спринцовки. Ако е необходимо, туморите са аспирирани за отстраняване на асцитна течност преди инжектиране на вируса.

Изобразяване на тумор in vivo

3 дни след инжектиране на вируса в OVCAR-3 тумори, мишките се инжектират интраперитонеално с 0,5 mCi 123I и се изобразяват на гама камера с ниска енергия на колиматор с висока разделителна способност. Серийни изображения бяха получени в различни моменти от 1 до 48 часа след приложението на йодид.

131 I терапия

Мишките бяха групирани според OVCAR-3 размер на тумора и интратуморални инжекции на Ad5-CMV-NIS, Ad5-MUC1-NIS или контролен вирус, както е описано по-горе. 3 дни след приложението на вируса, мишките се инжектират интраперитонеално или с 3 mCi 131 I, или с физиологичен разтвор (контролна група). Обемът на NIS-трансдуцирани и контролни тумори се проследява и сравнява ежеседмично след приложение на йодид както в 131 I, така и в физиологичен разтвор. Статистическият анализ беше извършен с помощта на t-тест на Student (несдвоен). Статистическата значимост е посочена с P-стойност ⩽ 0,05.

съкращения

Благодаря

Основният източник на финансиране за тази работа беше фондация Проспект Крийк. Подкрепа беше получена и от Фондация за рак на гърдата на Фондация Mayo, Програма за рак на простатата (CA91956) и Програма за рак на гърдата на Mayo.