елементи

Тази статия е актуализирана

абстрактно

Заден план:

МикроРНК (miRNAs) са ключови регулатори на генната експресия. В това проучване изследвахме дали променената експресия на miRNA играе важна роля при определянето на фенотипа на възпалителния рак на гърдата (IBC).

методи:

Използвахме количествена PCR технология за оценка на експресията на 384 miRNAs в 20 IBC и 50 не-IBC проби. За да разберем биологичните функции, дерегулирани от анормална експресия на miRNA, ние търсихме директни цели на miRNA чрез извършване на анализ на коефициент на двойна корелация на нивото на експресия на 10,962 messenger RNA (mRNA) и сравняване на тези резултати с прогнозираните цели на miRNA от TargetScan5. 1.

резултатите:

Идентифицирахме 13 miRNAs, за които нивата на експресия успяха правилно да предскажат естеството на анализираната проба (IBC срещу не-IBC). За тези miRNAs открихме общо 17 295 корелирани двойки miRNA-mRNA, от които 7012 и 10 283 двойки показаха отрицателни и положителни корелации. За четирите miRNAs (miR-29a, miR-30b, miR-342-3p и miR-520a-5p), корелираните гени бяха в съответствие с предвидените цели. Анализът на генното обогатяване на тези гени показа значително обогатяване в биологичните процеси, свързани с клетъчната пролиферация и предаването на сигнали.

заключение:

Доколкото ни е известно, това изследване представлява първият интегриран анализ на miRNAs и експресията на mRNA в IBC. Идентифицирахме набор от 13 miRNAs, чиято експресия се различава между IBCs и non-IBCs, което прави тези miRNAs кандидат-маркери за IBC подтип.

Основното

МикроРНК (miRNAs) са клас некодиращи РНК, способни да регулират генната експресия на пост-транскрипционно ниво чрез свързване към 3'-нетранслираната област на целевата медиаторна РНК (тРНК) чрез хомология на частичната последователност и предизвикваща транслационна блокада. и/или разграждане на иРНК (He и Hannon, 2004). По време на писането са описани 721 човешки miRNA гена (//microrna.sanger.ac.uk/sequences) и се изчислява, че всяка от miRNAs е насочена към приблизително 100 различни молекули на иРНК (Brennecke et al, 2005; Lewis et ал., 2005, Lim et al., 2005). MiRNAs играят важна роля в основни процеси като диференциация, растеж на клетките, реакция на стрес и клетъчна смърт (Miska, 2005; Zamore и Haley, 2005). В резултат на това променената експресия на miRNA е вероятно да допринесе за човешки заболявания, включително рак. Всъщност, спектърът на miRNAs, експресирани в твърди ракови заболявания, е много различен от този на нормалните клетки и прогнозираните цели за диференциално експресирани miRNAs са значително обогатени за протеинови супресори и кодиращи протеини онкогени (Lu et al, 2005; Volinia et al, 2005). 2006).

Те се фокусират върху рака на гърдата, нивата на специфични miRNAs варират между злокачествената и нормалната тъкан на гърдата и са в състояние да класифицират туморите според клинико-патологични променливи като индекс на пролиферация, рецептори на стероидни хормони и Her2/neu статус, възлов статус и туморен стадий ( Iorio et al., 2005; Mattie et al., 2006; Lowery et al., 2008). В допълнение, miRNAs се диференцирано експресират между молекулните подтипове на рак на гърдата, включително луминал А, луминал В, базал и Her2 + (Blenkiron et al, 2007). Това посочва потенциала на miRNA подписите като нови прогностични показатели, които могат да допринесат за подобрен избор на пациент за адювантна терапия. Foekens et al. (2008) наскоро свърза четири miRNAs (miR-7, miR-128a, miR-210 и miR-516-3p) с по-кратко време с отдалечени метастази в естрогенния рецептор (ER), в лимфните възли. отрицателен рак на гърдата.

Материали и методи

Пациентски проби

Проби от тумор са получени от тъканната банка на Обща болница Sint-Augustinus (Антверпен, Белгия). Клиничните и патологичните данни се съхраняват в база данни в съответствие с политиката за поверителност на болницата. Пробите се прехвърлят на патолози веднага след резекцията и част от тъканта се поставя в течен азот и след това се съхранява при -180 ° C. В това проучване са включени 20 пациенти с IBC и 50 пациенти без IBC. Възпалителният рак на гърдата е диагностициран съгласно критерии в AJCC (Американската смесена комисия по рака) -TNM система за постановка (Singletary et al, 2002). Всички пациенти с IBC показват дифузно увеличение на засегнатата внезапна поява на гърдата. Съобщава се за еритема и оток на кожата, които включват повече от една трета от гърдата. Наличието на дермална лимфна инвазия като изолирано наблюдение не е достатъчно за диагностицирането на IBC и не е необходимо за диагностициране. Контролна група от не-IBCs беше сравнена за хистология на тумора, експресия на ER и усилване на човешки епидермален растежен фактор 2 (HER2), но не и за туморен стадий, за да се идентифицират истински детерминанти на IBC. Характеристиките на тумора са показани в Таблица 1.

Маса в пълен размер

Пълна изолация на РНК, допълнителен синтез на ДНК и количествено определяне на miRNA

Статистика и биоинформатика

За да се намалят техническите вариации, всички miRNAs с граница на откриване на C (прагов цикъл) по-малко от 35 PCR цикъла в поне 25% от пробите бяха филтрирани, което доведе до списък с 322 информативни miRNAs. След това извършихме нормализиране между пробите чрез средно центриране на разпределението на нивата на експресия на miRNA за всяка проба (Mestdagh et al, 2009). Относителното ниво на експресия на miRNA беше изчислено по метода на Att (Livak and Schmittgen, 2001).

За да идентифицираме моделите на експресия на miRNA, извършихме йерархичен пълен без надзор клъстер анализ, използвайки евклидово разстояние като метрика за несъответствие. Броят на устойчивите клъстери на проби се определя от силуетния алгоритъм. По-нататък изследвахме връзката на резултатите от клъстерирането на проби с клиникопатологични променливи, използвайки теста на Пиърсън и глобалния тест на Goeman (Goeman et al, 2004).

За да идентифицираме отделни miRNAs, свързани с IBC, първо избрахме всички miRNAs, които бяха значително свръхекспресирани или недоекспресирани в IBCs в сравнение с не IBCs, използвайки непараметричен анализ. След това всяка от тези miRNAs беше подложена на многовариатен регресионен анализ с N състояние, М състояние, туморен стадий и HER2 амплификация като ковариати. По този начин бихме могли да идентифицираме miRNAs, които са специфично свързани с IBCs, а не разлики в клиникопатологичните променливи между IBCs и non-IBCs, за които също е известно, че влияят върху експресията на miRNA при рак на гърдата.

За да изследваме биологичната значимост на идентифицираните miRNAs, приехме стратегията, описана наскоро от Wang et al (2009). Първо, за всяка от miRNAs, които са независимо свързани с IBC, ние идентифицирахме набор от предполагаеми целеви гени, използвайки корелационен анализ на Spearman, като взехме предвид както положителните, така и отрицателните корелации. Този анализ е извършен върху подгрупа от 44 проби (20 IBC и 24 не-IBC проби), за които са налични Affymetrix HGU133 плюс 2.0 генни експресионни профила (Van Laere et al, 2007). За да идентифицираме истинските миРНК цели, сравнихме списъците с предполагаеми миРНК цели със списъците с миРНК цели, дефинирани от TargetScan5.1 (//www.targetscan.org), използвайки анализ на обогатяване на генен набор от хипергеометрични гени. Тези miRNAs, за които TargetScan5.1 дефинираните миРНК цели бяха значително обогатени за корелация, определени miRNA цели, бяха подложени на допълнителен анализ. Освен това всички други анализи бяха извършени само върху общите гени между двата комплекта миРНК цели. Тези гени бяха анализирани за обогатените категории на генната онтология (GO) и Киото енциклопедията на гените и геномите (KEGG) чрез анализ на обогатяването на геновия набор от хипергеометрични гени.

За да проверим дали идентифицираните miRNAs са прогностично значими, изтеглихме шест набора от данни за генна експресия от уебсайта на Националния център по биотехнологии (GSE7390, GSE9195, GSE1456, GSE11121, GSE2034 и GSE4922; //www.ncbi.nlm.nih), които са публично достъпни. gov). В допълнение, наборът от данни, описан от van de Vijver et al. (2002) е получена от уебсайта на Rosetta (http://www.rii.com). Като цяло анализирахме данните за експресия на иРНК от 1504 проби от рак на гърдата. За всяка проба изчислихме резултати, пропорционални на нивото на експресия на избраната miRNA, като извадихме средната стойност на отрицателно корелираните миРНК цели от средната стойност на положително корелираните миРНК цели. Тези резултати бяха стандартизирани (медиана = 0 и sd = 1), за да позволят сравнение между различни набори от данни и анализирани с помощта на модела на Кокс за пропорционални опасности както в едномерни, така и в многовариантни настройки. Получената променлива е преживяемост при отдалечени метастази (DMFS, N = 1059), обща преживяемост (OS, N = 652) или преживяемост без рецидив (RFS, N = 1145), ако е възможно.

И накрая, в рамките на подгрупа от 44 проби, за които бяха налични Affymetrix HGU133 плюс 2.0 генни експресионни профила, ние сравнихме експресията на miRNA обработващи гени между IBC и не-IBC. По-нататък анализирахме предполагаемия регулаторен ефект на всички miRNAs от базата данни TargetScan5.1 върху профилите на генна експресия от тези 44 проби. Ние възприехме подхода, публикуван наскоро от Cheng et al. (2009) за изчисляване на оценката на регулаторния ефект (RE) чрез изваждане на средното положение на миРНК целите от средната стойност на немиРНК целите, с високи стойности на РЕ, показващи силен ефект. miRNA за целева експресия и обратно. Тъй като обаче този резултат отчита само отрицателно регулирани миРНК цели, ние коригирахме RE резултата по такъв начин, че да се вземат предвид както инхибиторните, така и активиращите ефекти. След това тези RE резултати бяха сравнени между IBC и не-IBC, като се използва непараметричен тест.

Всички анализи на данни бяха извършени с помощта на биопроводник в R (//www.bioconductor.org). Корекцията за многократно тестване беше извършена с помощта на процедурата на Бенджамин и Хохберг, за да се увеличи честотата на фалшивите положителни резултати, а коригираните стойности на P 2 показаха, че групирането на проби е свързано с експресия на ER (P = 0.011), хистологична степен на тумора (P = 0,004)., Състояние N (P = 0,014) и туморен стадий (P = 0,010). Не се наблюдава връзка с групиране на проби за Т и М статус, амплификация на HER2 или подтип на тумора (IBC или не-IBC).

експресионен

Йерархично групиране на 20 IBCs и 50 не-IBC проби според модела на експресия на 50 различни miRNAs. Стойностите на изразяване за тези 50 miRNAs са представени в матричен формат, с редове, обозначаващи miRNAs и ленти, показващи проби. Високите стойности на израз са оцветени в червено, а ниските стойности на израз са оцветени в синьо. Бяха идентифицирани три стабилни клъстера проби, които бяха значително свързани с експресията на ER и хистологичната степен. По-специално, комбинираните първи две (сини и жълти) клъстери от проби са обогатени за ER + тумори на гърдата (80% от пробите) в сравнение с третия (червен) клъстер от проби (50% от пробите) (P χ 2 = (0, 028). В (синия) клъстер за вземане на проби 20% от пробите са слабо диференцирани в сравнение с 60% от пробите във втория (жълт) клъстер за проби (P 2 = 0,004), което показва разделяне на ER + тумори на гърдата в луминални А и луминални В подтипове. Не се наблюдава връзка на групиране на проби с разликата между IBCs и non-IBCs: 30, 25 и 45% от IBC пробите, групирани в първия (син), втори (жълт) и трети (червен) клъстери на проби (P = 2 = 0,082). (Цветното възпроизвеждане на това изображение е налично в пълната html версия на ръкописа.)

Изображение в пълен размер

Глобалният анализ на Goeman беше извършен, за да се определят асоциациите на експресията на miRNA с различни клиникопатологични фактори (Таблица 2) за намален набор от данни, състоящ се от 50 различни miRNA. Наблюдават се значими асоциации за експресия на ER и хистологична степен на тумора, но не и за Т, N или M статус, туморен стадий, HER2 усилване или туморен подтип (IBC или не-IBC). По този начин, най-голямата разлика в експресията на miRNA в нашия набор от проби от рак на гърдата се дължи на разликите в експресията на рецептора на стероидни хормони и хистологията на тумора, а не на разликите между IBC и не-IBC. Всъщност общото разпределение на стойностите на експресия на miRNA в IBC и не-IBC изглежда много сходно (Фигура 2).

Маса в пълен размер

Разпределение на стойностите на експресия на miRNA в ( A ) възпалителни тумори на гърдата и ( Б. ) на невъзпалителни тумори на гърдата.

Изображение в пълен размер

Асоциация на отделни miRNAs с възпалителен рак на гърдата

Извършен е логистичен регресионен анализ, за ​​да се идентифицират разликите в нивата на експресия на miRNA между IBC и не-IBC проби (Таблица 3). Забелязано е, че малко miRNAs са независимо свързани с разликата между IBCs и non-IBCs. Повишена експресия на miR-335, miR-337-5p, miR-451, miR-486-3p, miR-520a-5p и miR-548d-5p се наблюдава в IBC подтипа, докато miR-15a, miR-24, miR -29a, miR-30b, miR-320, miR-342-5p и miR-432-3p бяха значително регулирани в сравнение с не-IBC.

Маса в пълен размер

Подобен анализ беше извършен за идентифициране на разликите в експресията на miRNA между пробите по Т състояние (ниско спрямо високо), N състояние (положително срещу отрицателно), М състояние, туморен стадий (ниско срещу високо), степен на тумор (високо срещу ниско), ER експресия и HER2 усилване. Асоциациите на miRNAs с тези клиникопатологични фактори също са изброени в таблица 3.

Прогнозиране на миРНК цели и тяхното участие в биологични процеси

По-нататък изследвахме участието на целеви гени на miRNA в различни биологични процеси, които могат да показват функция на miRNA, като приехме стратегия, описана наскоро от Wang et al (2009). Първо направихме анализ на коефициент на корелация, за да оценим потенциалните корелации между нивата на експресия на 13 IBC-свързани miRNAs (miR-335, miR-337-5p, miR-451, miR-486-3p, miR-520a-5p, miR -548d -5p, miR-15a, miR-24, miR-29a, miR-30b, miR-320, miR-342-5p и miR-342-3p) и нивата на експресия на mRNA от 10 961 известни гена в намален пул от 44 рака проби гърди, от които 20 са IBC и 24 са не IBC. Използване на фалшива мярка за откриване

Анализ на Kaplan-Meier за оцеляване на експресията на целевия ген на miR-520a-5p при отдалечен метастатичен рак на гърдата ( A а ° С ) и общата преживяемост ( Б. а д ) като резултат от. Кривите на Каплан-Майер са дадени за наборите от данни на Van de Vijver et al (2002) ( A а Б. ) и Desmedta et al (2007) ( ° С а д ).

Изображение в пълен размер

Маса в пълен размер

Експресия на гени за обработка на miRNA при рак на гърдата

Тъй като IBC се счита за модел на агресивност на рака на гърдата, ние се интересувахме от това дали специфичните за IBC miRNAs са свързани с неутрална прогноза при пациенти без IBC. Поради ограничения брой наши клинични проби, ние използвахме индиректен подход и корелирахме експресията на целевия ген miRNA с резултатите от пациентите, като използвахме публично достъпна информация от проучвания с микрочипове, които биха могли да бъдат извлечени от базата данни за генна експресия. Този анализ демонстрира силна връзка на експресията на целевия ген на miR-520a-5p с по-кратки DMFS, RFS или OS в повечето от изследваните набори от данни за рак на гърдата. Този резултат показва възможната роля на miR-520a-5p като прогностичен фактор при рак на гърдата. Въпреки че признават ограниченията на използването на косвения подход, тези видове изследвания могат да помогнат за насочване на бъдещи мащабни проучвания за прогностичната стойност на miRNAs при рак на гърдата.

В заключение, това проучване, доколкото ни е известно, представлява първият интегриран анализ на експресията на miRNA и mRNA в IBC. Идентифицирахме броя на miRNAs, които са различно изразени между IBCs и non-IBCs. Освен това докладвахме променената експресия на гени за обработка на miRNA в IBCs в сравнение с не-IBCs. В случая на четири от свързаните с IBC miRNAs, успяхме да открием различни биологични процеси, които могат да показват функцията на тези miRNAs и да посочат потенциалната им връзка с прогнозата за рак на гърдата въз основа на нивата на експресия на техните целеви гени.