елементи
абстрактно
Събирането и съхранението на амилоиден β протеин (Aβ) е основно събитие в ранните стадии на болестта на Алцхаймер (AD) и церебралната амилоидна ангиопатия. Все повече доказателства предполагат, че ганглиозидите формират патологична платформа за образуване на свързан с Ар ганглиозид, което улеснява сглобяването на разтворим Ар; обаче, молекулярните механизми, лежащи в основата на свързването на Ар с ганглиозидите в мозъка, остават неясни поради липсата на in vivo система, която би могла да се справи с този проблем. При насекомите, включително плодовата муха Drosophila melanogaster, ганглиозидите не присъстват естествено на откриваемо ниво. Тук демонстрирахме, че експресията на ганглиозиди е индуцируема при дрозофила чрез експресията на трансгени на ензими за синтез на ганглиозиди и доставянето на екзогенна сиалова киселина, а също така, че индуцирането на синтеза на ганглиозиди значително ускорява сглобяването на Aβ in vivo. Нашите резултати подкрепят хипотезата, че ганглиозидите са отговорни за сглобяването на Ар in vivo и също така дават възможност за разработване на ценен модел за основни изследвания, както и терапевтична стратегия за БА.
По време на разследването на хипотезата на GAp, зоната на фокус беше специфичното за площта отлагане на варианти на видове Aβ, които са генетично наследени. Например, холандски тип мутация (E22Q) причинява отлагане на амилоид предимно в мозъчната съдова стена 5, 6, което предполага, че тази стена, която се състои главно от съдови гладкомускулни клетки, изразява уникални ганглиозиди, които благоприятно инициират холандската агрегация на клетките. тип Ap. За да изследваме тази възможност, анализирахме ганглиозиди в гладкомускулните клетки на съдовете и открихме изключителна експресия на GM3 и в по-малка степен GM2 7. Освен това, както се очакваше, сглобяването на холандския тип Aβ се увеличи значително в присъствието на GM3 7 .
Целта на това проучване беше да се изследва допълнително хипотезата на GAp, използвайки модела на Drosophila, при който индуцирането на GM3 и Aß от холандски тип беше манипулирано. Тук демонстрирахме, че сглобката Aß от холандски тип е значително ускорена при мухи, предизвикани от GM3.
резултатът
Трансгенна индукция на GalT6 и SAT1 за производството на LacCer
Ганглиозидите са гликосфинголипиди и са еволюционно запазени при бозайниците; обаче повечето безгръбначни, включително насекомите, не съдържат ганглиозиди в клетките си. В начален етап от пътя на синтеза на ганглиозиди на бозайници, GM3 се генерира от глюкозилцерамид (GlcCer) чрез лактозилцерамид (LacCer) (фиг. 1). Синтезът на GM3 (фиг. 1) е отговорен за 1,4-галактозилтрансфераза LacCer синтаза ß1, 4-галактозилтрансфераза (GalT6/5) и α2,3-сиалилтрансфераза GM3 синтаза (SAT1, известна също като ST3GAL5 или GM3S).
Схема за индукция на ганглиозиди. Пътят на синтеза на ганглиозидите на бозайниците (вляво), ендогенният път на дрозофила (средата 8) и трансгенният път на дрозофила (вдясно в това проучване). Попълнените кутии показват донори на захар или SA. При гръбначните животни първият ганглиозид, GM3, се образува от глюкозилцерамид (GlcCer) чрез лактозилцерамид (LacCer). В ендогенния път на дрозофила, GlcCer се модифицира от манозилтрансферазата Egghead и GlcNAc трансферазата Brainiac. Ние индуцирахме експресия на GM3, използвайки трансгенни (Tg) конструкции и хранещи донорски SA мухи. В допълнение, пътят на синтез на CMP-SA е частично запазен в дрозофила (вж. Допълнителна фигура S2).
Изображение в пълен размер
Тъй като GalT6/5 и SAT1 не бяха открити в дрозофила, ние създадохме GM3 индукционна система с трансгенни мухи, носещи човешки GalT6 и SAT1 (фиг. 1). Тези трансгени бяха експресирани с пан-невроналния драйвер C155-Gal4 и общите липиди бяха извлечени от възрастни летящи глави. Използвайки течна хроматография-масспектрометрия (LC-MS), идентифицирахме сигнали хексоза-хексоза-Cer (Hex-Hex-Cer) в мухи, експресиращи GalT6, но не и в мухи, които не експресират GalT6 (Допълнителна фигура S1). Тъй като ендогенният Man-Glc-Cer (MacCer) е бързо метаболизиран междинен продукт и трансгенният GalT6 е отговорен за биосинтеза на LacCer, тези сигнали могат да бъдат отдадени на генерирането на Gal-Glc-Cer (LacCer), което предполага, че екзогенният GalT6 индуцира LacCer в дрозофила както по-горе 8 (фиг. 2а, в).
LC-MS анализ на LacCer и GM3. Екстрахираните липиди от глави на дрозофила се анализират чрез LC-MS MRM. Предполагаше се, че всички керамидни структури на LacCer и GM3 са налице въз основа на предишно проучване, показващо, че най-разпространените видове керамиди в дрозофила съдържат сфингозин ( d14: 1 ) 17. Липиди от ларва на ЦНС, експресиращи трансгени ( а ) GalT6 и SAT1 или ( б ) GalT6, SAT1 и GNE. Липиди от главите на възрастни мухи ( ° С ) ко-експресни трансгени за GalT6 и SAT1 или ( д ) ко-експресират трансгени за GalT6 и SAT1 и захранват Neu5Ac.
Изображение в пълен размер
Експериментална индукция на GM3 при мухи
Също така изразихме SAT1 при плодови мухи с GalT6; Въпреки това, GM3 не е синтезиран при тези мухи (Фигури 2а, в и Таблица 1). Ние предположихме, че метаболизмът на SA при насекоми може да се различава от метаболизма при бозайници 9. В подкрепа на тази идея, предишни проучвания са установили, че донорът на SA цитозин-5'-монофосфат (CMP) -Neu5Ac не е открит при плодовите мухи, въпреки че е публикувана функционална сиалилтрансфераза Drosophila 10, 11, 12, 13. Смятахме, че CMP-Neu5Ac може да не е на разположение за гликолипидни модификации и предположихме, че това е причината за липсата на производство на ганглиозиди при плодовите мухи. Използвали сме генетични и химични подходи за решаване на този проблем.
Маса в пълен размер
Ускоряване на сглобяването на Aβ in vivo при мухи, предизвикани от GM3
Предишни проучвания показват, че GM3 показва силен афинитет към холандския тип Ар и връзката между GM3 и холандския тип Ар ускорява in vitro сглобяването на Ар 7,18. За да потвърдим тези констатации, използвайки нашата GM3 индукционна система, генерирахме трансгенни мухи, носещи холандски тип Aβ40 или Aβ42 (по-долу Dut40 или Dut42). При пациенти с хора и трансгенни мишки с мутант от холандски тип, Ар40 се намира предимно в амилоидни отлагания 19. Използвахме див тип Aβ42 (WT42) като контрол за пътя на производство на Aβ, тъй като пациентите със спорадичен тип AD и A прекурсорни протеини-трансгенни мишки показват доминиращи Aβ42 отлагания и див тип Aβ има значително по-слаб афинитет от Dut40 към GM3. 18. .
Трансгенните GalT6, SAT1 и WT42 или Dut40 непрекъснато се експресират в нервната система на мухата и GM3 се индуцира в тези мухи чрез хранене с Neu5Ac, както е описано по-горе. Целите екстракти от възрастни перки се разделят на TBS-разтворими и неразтворими фракции. Синтезът на GM3 ускори сглобяването на Dut40 в мозъка им (фиг. 3а, в). За разлика от това, WT42 не ускорява сглобяването при тези условия (Фиг. 3b, c). Храненето с Neu5Ac само не е увеличило сглобяването на Dut40 при мухи, експресиращи не GalT6/SAT1 (фиг. 3d), което предполага, че Dut40 е по-податлив на натрупване в присъствието на GM3 in vivo и че GM3 не влияе на Aβ на тези нива. производство.
Освен че участват в патологичния процес на развитие на AD, ганглиозидите са фактор и при други заболявания при хората, напр. Захарен диабет тип 2, глухота, туморна инвазия и болест на Паркинсон (PD) 22, 28, 29, 30. При пациенти със захарен диабет тип 2 повишените нива на GM3 причиняват инактивиране на инсулиновия рецептор чрез нарушаване на мембранните микродомени, което води до инсулинова резистентност 28. Обратно, загубата на GM3 предизвиква слухова дисфункция, тъй като е необходима за поддържане на правилната структура на кохлеарните космени клетки 22. Доказано е, че намалената индукция на GM3 е свързана със злокачествена трансформация 29. В допълнение, скорошно проучване съобщава, че in vitro лечението с ганглиозид води до ускорено натрупване на α-синуклеин, основен причинителен фактор на PD31. По този начин нашата индуцируема система за индукция на GM3 в дрозофила може да допринесе за нашето разбиране на механизмите, лежащи в основата на развитието на тези човешки заболявания.
методи
Fly запас
Мухите се поддържат на стандартна агарова среда с царевично брашно и мая при 25 ° С в 12-часов цикъл светлина/тъмнина. Линията elav-GAL4 c155 (C155-Gal4) е получена от Stock Center Bloomington Drosophila Stock Center (University of Indiana). Щамът w1118 служи като див тип. UAS-sec: В предишното ни проучване 32 е генериран див тип ß 1-42 (UAS-WT42). UAS-GalT6, UAS-SAT1, UAS-GNE и UAS-sec: В това проучване (описано по-долу) са генерирани Api-40 E22Q (UAS-Dut40).
Изграждане на трансгени
Конструкцията на Ар трансген е описана по-рано 32. Накратко, Ар последователността се амплифицира чрез PCR от кДНК на HeLa клетки и се слива със сигналния пептид 33, 34 на проенкефалин-А. Мутацията на Aβ от холандски тип (подчертана) е въведена в клонираната Aβ последователност чрез PCR амплификация (Pfu ДНК полимераза, Promega) във връзка с праймери: 5 'GTGTTCTTTGCACAAGATGTGGGTTCAA 3' (напред) и 5 'TTGAACCCACATCTTTGTGCAAAGAACAACkACACAACkACAC 3AC (3) '(пре) към вектора pUAST 35 с Bgl II сайтове.
Кодиращите последователности на човешки GalT6, SAT1 и GNE се амплифицират от cDNA на човешкия мозък (Takara), клонират се в pCR-Blunt II-TOPO вектор (Life Technologies) и след това индивидуално се субклонират в EcoR I сайтовете на pUAST вектора. Използвани са следните грундове. Клониране на GalT6: 5 'ATGTCTGTGCTCAGGCGGAT 3' (напред) и 5 'CTTGCCACGACAGCCACTTC 3' (обърнат); Клониране на SAT1: 5 ′ CATTAGTATGCGGACGAAGG 3 ′ (напред) и 5 ′ GCTCTCAGAGTTAGAGTTGC 3 ′ (обърнат); Клониране на GNE: 5 ′ CATGGAGAAGAATGGAAATAACCGA 3 ′ (напред) и 5 ′ CTAGTAGATCCTGCGTGTTG 3 ′ (назад). Всеки трансген се инжектира в жълто-бели ембриони и след това се кръстосва със щам w 1118 .
GM3 индукция и масспектрометрия
Възрастните мухи получават свободен достъп до филтърна хартия, напоена с 10 mM N-ацетилневраминова киселина (Neu5Ac, Sigma) в 150 mM захароза през ден в продължение на една седмица. Наблюдавахме, че Neu5Ac се улавя от мухи чрез добавяне на оцветител за храна към разтвора на Neu5Ac (данните не са показани). Екстракцията на липиди се извършва, както е описано по-горе 36. От мухите бяха отстранени 200 до 1000 комплекса мозъчни дискове на ларви и възрастни глави на възрастни, всяка група органи беше отделно обединена и хомогенизирана в TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7, 6, 150 mM NaCl) и след това хомогенатите бяха изпарени. с помощта на центробежен концентратор (Tomy). Пелетите се суспендират в хлороформ: метанол 2: 1 (v/v) и се центрофугират при 17 800 х g при 20 ° С за 2 минути. Двата екстракта от разтворители се комбинират и се сушат при 42 ° С под N2 газ.
Уестърн петна
Благодаря
Това проучване беше подкрепено от Изследователските фондове за науките за дълголетието (номера на безвъзмездните средства 25-19 за KY и 28-46 за LT) от Националния център по гериатрия и геронтология на Япония.
Електронен допълнителен материал
Допълнителна информация
Коментари
Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.