елементи

абстрактно

Адипонектинът играе ключова роля в регулирането на енергийната хомеостаза на цялото тяло чрез модулиране на метаболизма на глюкозата и липидите. Въпреки че намаляването на експресията на адипонектин, индуцирано от затлъстяване, се дължи предимно на провал на транскрипционната регулация, основните механизми са до голяма степен недефинирани. Тук показахме, че хиперметилирането на ДНК на определен регион на адипонектиновия промотор потиска експресията на адипонектин чрез епигенетичен контрол и впоследствие обостря метаболитните заболявания при затлъстяване. Индуцираните от затлъстяването противовъзпалителни цитокини насърчават експресията на DNMT1 и ензимната активност. Активираният DNMT1 селективно метилира и стимулира компактна хроматинова структура в промотора на адипонектин, което предотвратява експресията на адипонектин. Потискането на активността на DNMT1 от инхибитор на DNMT доведе до подобряване на индуцираната от затлъстяването непоносимост към глюкоза и инсулинова резистентност по зависим от адипонектин начин. Тези открития предполагат критична роля за епигенетичния контрол на гена на адипонектин от DNMT1 в управлението на енергийната хомеостаза, което предполага, че модулацията на активността на DNMT1 представлява нова стратегия за лечение на заболявания, свързани със затлъстяването.

Епигенетичната регулация, включително метилирането на ДНК, е един от ключовите механизми за регулиране на еукариотната генна експресия без модификация на ДНК последователността 1. Натрупването на доказателства показа, че метилирането на ДНК ще служи като мост между промените в околната среда и клетъчните реакции. По-специално, хранителният статус диференцирано модулира метилирането на ДНК в няколко метаболитни гена, включително хепатоцитен ядрен фактор 4α, панкреатичен и дуоденален хомеобокс 1 (Pdx1), активиран от пероксизома пролифератор рецептор (Ppar) y коактиватор -1 α (Pgc-1 α) 2, 3 4, 5. Интересното е, че няколко доклада показват, че консумацията на диети с високо съдържание на мазнини (HFD) засяга епигенетиката на различни гени, участващи в наследяването на следващото поколение метаболитни дисбаланси, свързани с инсулиновата чувствителност 6, 7 .

Адипонектинът, който се експресира селективно в адипоцити, модулира хомеостазата на цялото тяло чрез регулиране на глюкозния и липидния метаболизъм 8, 9. В метаболитните тъкани адипонектинът повишава инсулиновата чувствителност, като стимулира усвояването на глюкозата и окисляването на мастните киселини 9, 10. Освен това адипонектинът потиска имунния отговор, предизвикан от затлъстяване и развитието на атерогенни рискови фактори 11, 12. По този начин, добавянето на адипонектин или агонист на адипонектинови рецептори подобрява инсулиновата чувствителност и метаболитните параметри при модели със затлъстели животни 13, 14. Интересното е, че експресията на адипонектин и серумните нива са в отрицателна корелация със свързаните със затлъстяването метаболитни заболявания като инсулинова резистентност, диабет тип 2 и сърдечно-съдови заболявания.

По принцип експресията на адипонектин се контролира в няколко регулаторни етапа, като транскрипционна и посттранслационна регулация, включително олигомерно подреждане и секреция. При затлъстяването такъв регулаторен механизъм на адипонектин се нарушава от няколко фактора, включително хипертрофия на адипоцитите, възпаление и оксидативен стрес, водещи до хипоадипонектинемия 15, 16, 17. Сред тях, все повече доказателства показват, че хипоадипонектинемията при затлъстяване се дължи предимно на неуспех в транскрипцията 19. Важно е, че основният молекулярен механизъм, медииращ подобна дисрегулация при затлъстяване, не е изяснен. По-специално, не е изследвано дали епигенетичните промени, като метилиране на ДНК, играят роля при нарушаване на експресията на гена на адипонектин при затлъстяване.

В това проучване ние изследвахме ролята на метилирането на ДНК в експресията на гена на адипонектин. Установихме, че хиперметилирането на адипонектиновия промотор инхибира транскрипцията на адипонектин. В допълнение, ДНК метилирането в адипонектиновия промотор се медиира от ДНК метилтрансфераза (DNMT) 1, чиято експресия се увеличава в адипоцитите при затлъстели индивиди. В допълнение, стимулирането на експресията на адипонектин чрез потискане на активността на DNMT1 потиска възпалителните отговори и повишава инсулиновата чувствителност при затлъстели мишки, което ще даде нови прозрения в механизмите, подпомагащи препрограмирането на експресията на гена на адипонектин чрез ДНК метилиране при метаболитни усложнения.

резултатът

Промоторът на адипонектин е хиперметилиран при лица със затлъстяване

В съответствие с предишни доклади 15, 18, 19, нивата на адипонектин иРНК са значително намалени в адипоцити от затлъстели мишки, хранени с HFD, докато нивата на иРНК на ключови адипонектин-регулиращи транскрипционни фактори, включително Ppary2 или CCAAT/свързващ протеин а (C/ebp) ) не са променени значително (Допълнителна фигура 1а). Това наблюдение ни доведе до спекулации относно възможността за алтернативни пътища, участващи в транскрипционната репресия на адипонектин при затлъстяване. Сред различните биологични процеси ДНК метилирането е един от ключовите регулаторни механизми на транскрипцията, който контролира достъпа на транскрипционния механизъм до целевите места чрез модулация на хроматиновата структура 20. В допълнение, последните открития показват, че метилирането на ДНК е активен регулаторен механизъм, отговарящ на промени в хранителните етикети с множество ефекти върху регулирането на системната енергийна хомеостаза 2, 3, 4, 5, 6, 7 .

затлъстяване

Диференцираните 3T3-L1 адипоцити се инкубират с TNFa (10 ng ml-1) или IL-1β (10 ng ml-1) в продължение на 24 часа или без. ( а, б ) нива на иРНК на адипонектин, Dnmt1 и Mcp-1. ( ° С ) относителна ензимна активност на DNMT. ( д, д ) Анализ на R2 бисулфитна последователност и количествено определяне на 5-mC. ( е ) Тест за достъпност на рестрикционния ензим. нивата на тРНК бяха измерени чрез qPCR. ( ж ) R2 ChIP анализ. Резултатите се изразяват като средната стойност ± 3 независими проби (n = 3). Подобни резултати бяха получени чрез поне повече от три независими експеримента. * Р

Мишки db/db или адипонектин и рецептор за лептин DKO се инжектират с носител (1% DMSO; Veh, n = 4-5) или RG108 (n = 4-5). ( а ) Серумните нива на адипонектин се определят чрез ELISA. б ) Нива на глюкоза и инсулин на гладно. ° С ) серумни нива на TG. д ) OGTT. След гладуване в продължение на 16 часа, мишките се инжектират интраперитонеално с 1 g kg-1 телесно тегло глюкоза и се проследяват нивата на глюкоза в кръвта. Представени са времеви курсове на кръвен клирънс и AUC. ( д ) Нивата на възпалителни генни иРНК бяха изследвани в eWAT. нивата на тРНК бяха измерени чрез qPCR. ( е ) Хистологичен анализ на черния дроб (H&E оцветяване). Скала, 50 μm. ж ) Чернодробно съдържание на TG. Резултатите са изразени като средно ± sem * P

При затлъстяване, повишеният DNMT1 индуцира ДНК хиперметилиране в определен регион (R2) на адипонектиновия промотор, което води до потискане на експресията на гена на адипонектин в адипоцитите.

Изображение в пълен размер

Тъй като мастната тъкан едновременно се сблъсква с взаимосвързани метаболитни усложнения, включително хронично възпаление, стрес на ендоплазматичния ретикулум, митохондриална дисфункция и хипоксия при затлъстяване 31, 32, ние изследвахме кои фактори играят критична роля за потискане на експресията на адипонектинов ген в DNMT1-медиирани адипоцити. възпалително сигнализиране, като TNFα и IL-1β, стимулира експресията/активността на DNMT1 и подобрява метилирането на ДНК в R2 в адипоцитите, което потиска експресията на адипонектин. От друга страна, острото лечение на туникамицин, ротенон или хипоксия силно потиска експресията на гена на адипонектин, независимо от експресията на DNMT1 и последващото метилиране на ДНК. Тези патофизиологични състояния обаче се споделят от много играчи и точки за кръстосано изслушване, което в крайна сметка води до дисрегулация на мастната тъкан31. По този начин индуцираното от затлъстяването хиперметилиране на R2 in vivo е по-вероятно поради натрупването на противовъзпалителни отговори от няколко фактора, участващи в дисрегулацията на мастната тъкан.

В това проучване идентифицирахме няколко кандидати, свързани с R2 или R2-свързани протеини в отговор на провъзпалителна стимулация. Налице е увеличаване на свързването на някои видове транскрипционни регулаторни протеини, участващи в модификацията на хистони върху R2. Например, известен е фактор на сплайсинг фактор, богат на пролин и глутамин (SFPQ) и делта 3-подобна убиквитин лигаза (DTX3L), които са свързани с R2 върху TNFα, които участват в транскрипционната репресия и ремоделиране на хроматин 33, 34. В допълнение, както предполагат допълнителни доклади 35, 36, 37, DNMT1 има способността да метилира селективни ДНК последователности чрез образуване на комплекси със специфични транскрипционни фактори. По този начин е вероятно DNMT1 да се доведе до R2 чрез взаимодействие с определен транскрипционен фактор (и), чието свързване с R2 би било променено от затлъстяването. Следователно е очевидно важно да се изяснят ролите на тези новоидентифицирани протеини в медиираното от затлъстяването потискане на адипонектин в бъдещи проучвания.

Предишни проучвания разглеждат корелацията между единичните нуклеотидни полиморфизми на човешки адипонектин (SNP) и нивата на серумен адипонектин 38, 39, 40, 41, 42. Интересното е, че два SNP (rs17300539 и rs266729), които показват значителна корелация със серумните нива на адипонектин 43, 44, 45, 46, са разположени в R2 на промотора на човешкия адипонектин и могат да служат като CpG динуклеотиди, тъй като C е предната позиция на всеки SNP (допълнителна фигура 2). Например, хора с заместване от G към A (генотип rs17300539 A/A) показват по-високи плазмени нива на адипонектин в плазмата, отколкото индивиди с генотип rs17300539 G/G. По същия начин, хора с заместване от C до G (rs266729 G/G генотип) показват по-ниски плазмени концентрации на адипонектин в сравнение с индивиди с C/C генотип. Следователно, нашите открития и данни за човешки SNP силно подкрепят критичната роля на ДНК хиперметилирането за потискане на експресията на адипонектин.

Като цяло това проучване илюстрира един от ключовите регулаторни региони в гена на адипонектин, чиято ДНК модификация и ремоделиране на хроматин са важни за потискане на индуцираната от затлъстяването експресия на адипонектин. По-специално, тези данни показват възможността за стимулиране на експресията на адипонектин чрез инхибитор на DNMT за потенциални терапевтични средства срещу заболявания, свързани със затлъстяването.

методи

Експерименти с животни

Измерване на серумни протеини и липиди

Нивата на серумен инсулин бяха измерени чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (Shibayagi Co. Ltd., AKRIN-001T). Активността на серумна аланин аминотрансфераза и аспартат аминотрансфераза се измерва, като се използва комплект за анализ на активността (Biovision, K752-100, K753-100 и Sigma Aldrich, MAK052-1KT, MAK055-1KT). Тестовите комплекти бяха използвани за измерване на серумен TG (Thermo Fischer Scientific Inc., TR22321 и Sigma Aldrich, T2449-10ML) и FFA (Roche, 11,383,174,001). Нивата на серумен адипонектин са измерени с помощта на домашен комплект ELISA (Университет в Хонг Конг). Анализът и количественото определяне на олигомеризацията на адипонектин се извършва с помощта на гел филтрация, както е описано по-горе 47. Накратко, 10 μl серум се разреждат с 1 ml PBS. Разредените серуми се нанасят върху AKTA explorer флаш протеинова хроматографска система, фракционират се върху колона Hiload 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare, 28-9893-35) и се елуират с PBS при скорост на потока 1 ml min-1. Всяка фракция от 0,5 ml се събира и се подлага на ELISA анализ.

Човешки проби

Проби от човешка мастна тъкан са получени от 12 субекта от Центъра за изследване на затлъстяването към Медицинския колеж към Университета Крал Сауд, Рияд, Саудитска Арабия. Протоколът е одобрен от Комитета по етика на колежа по медицина, Университет Кинг Сауд, и е получено писмено информирано съгласие от всички участници за записване в проучването. След фракциониране на адипоцитите и екстракция на геномна ДНК, нивата на метилиране на адипонектиновия промотор на R2 областта се анализират чрез бисулфитно секвениране. След екстракция на РНК, РНК се транскрибира обратно в комплементарна ДНК (cDNA) и след това се използва в количествена PCR в реално време (qPCR).

Фракциониране на мастната тъкан и поточна цитометрия

Пречистване на геномна ДНК и бисулфитно секвениране

ДНК се пречиства чрез екстракция с фенол и хлороформ. Клетките се лизират в продължение на 1 час в лизисен буфер (50 mM Tris-Cl (рН 8,0), 50 mM етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA; рН 8,0), 100 mM NaCl, 2% SDS и 20 μg ml-1 RNase) при 37 ° C и се усвоява с 10 μg ml-1 протеиназа К в продължение на 3 часа при 50 ° С. Превръщането на бисулфит се извършва с помощта на EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, 59104). Преобразуваната ДНК се амплифицира чрез PCR, като се използват праймери, проектирани със софтуера Methprimer (www.urogene.org/methprimer/index1.html). PCR условията са 95 ° C за 7 минути и 35 цикъла при 95 ° C за 1 минута, 55 ° C 30 и 72 ° C за 1 минута, последвани от 10 минути при 72 ° C. PCR продукти, клонирани в бактерии, използвайки TOPO TA комплект за клониране (Invitrogen, 450641). Осем клонинги за всяка проба бяха секвенирани, използвайки търговски услуги на COSMO Genetech. Последователностите на праймерите, използвани за PCR, са изброени в Допълнителна таблица 2.

Клетъчна култура и преходна трансфекция

3T3-L1 клетки са получени от ATCC (CL-173). 3T3-L1 клетки се отглеждат до сливане в модифицираната от Dulbecco среда на Eagle (DMEM; Hyclone, SH30243.01), допълнена с 10% говежди телешки серум (Gibco, 26010-074). За да се индуцира диференциация на адипоцитите, 3T3-L1 клетки се инкубират с DMEM, съдържащ 10% фетален говежди серум (FBS; Hyclone, SH30919.03), 0.55 mM 3-изобутил-1-метилксантин (Sigma Aldrich, I5879) 2 дни след сливането. дексаметазон (Sigma Aldrich, D1756) и 1 μg ml-1 инсулин (Roche, 11 376 497 001) за 2 дни. След това хранителната среда беше заменена с DMEM, съдържаща 10% FBS и 1 μg ml-1 инсулин, и клетките бяха култивирани за още 2 дни. Културната среда се сменя на всеки 2 дни с DMEM, съдържащ 10% FBS.

Малки интерфериращи РНК дуплекси са проектирани и закупени от Bioneer (DNMT1, 1350629; DNMT3a, 1350650). Векторът pcDNA3-DNMT1 е любезно дарен от Dr. Франсоа Фукс (Свободен университет в Брюксел, Белгия). Всяка малка интерферираща РНК (20 μM), pcDNA3.1-myc-His и pcDNA3.1-DNMT1 бяха доставени в клетки 3T3-L1 с помощта на микропоратор (Digital Bio Technology Co. Ltd.).

В различни патологични експерименти, имитиращи околната среда, диференцирани 3T3-L1 адипоцити се инкубират със или без 10 ng ml-1 TNFα (R&D Systems, 210-TA), 10 ng ml-1 IL-1β (R&D Systems, 201-LB) 1 ug ml-1 туникамицин (Calbiochem, 654080), 1 μM ротенон (Sigma Aldrich, R8875) или инкубира при нормални или хипоксични условия (1% концентрация на O2) в продължение на 24 часа. За да се инхибира активността на DNMT1, адипоцитите на 3T3-L1 бяха предварително инкубирани с RG108 (100 μM) 24 часа преди лечението с TNFα.

Изолиране на РНК и qPCR

Процедурата за изолиране на РНК и синтеза на cDNA се извършва, както е описано по-горе. Накратко, общата РНК беше изолирана от миши клетки или клетъчни линии с TRIzol Reagent (Ambion, 15596-018) и подложена на синтез на cDNA с помощта на синтезационния комплект за cPNA Maxima First Strand за qPCR (Thermo Scientific, K1642). РНК от пречистени човешки адипоцити се екстрахира с помощта на RNeasy Lipid Tissue Kit (Qiagen, 74804) и се подлага на синтез на cDNA, използвайки комплект с голям капацитет RNA-to-cDNA (Applied Biosystems, 4387406). Относителните нива на иРНК се измерват с помощта на система CFX96 в реално време (Bio-Rad Laboratories Inc.) и се изчисляват чрез нормализиране до нивата на иРНК на циклофилин (миши клетки или клетъчни линии) или нива на GAPDH иРНК (човешки клетки). Последователностите на праймерите, използвани за количествени PCR анализи в реално време, са изброени в Допълнителна таблица 3.

Тест за достъпност на ограничаващ ензим

Анализът за достъпност на рестрикционния ензим е описан по-рано 50. Накратко, адипоцитите на епидидималната мастна тъкан и 3T3-L1 клетките се събират с RSB буфер (10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 0.1% Nonidet P-40 (NP-40), 5 mM бутират, 10 mM NaF и 1 mM NaVO 7, допълнен с протеазни инхибитори) и се инкубира в продължение на 20 минути върху лед. Клетъчните пелети се хомогенизират с помощта на 27 g спринцовки, центрофугират се при 2000 rpm при 4 ° С в продължение на 5 минути и се суспендират отново в 100 μl пресен RSB буфер. Ресуспендираната gDNA се усвоява със 100 U AluI, EcoRI и BamHI (TaKaRa, 1004A, 1040A и 1010A). Реакциите бяха спрени чрез добавяне на протеиназа К и 2% SDS в продължение на 6 часа при 45 ° С. Хромозомната ДНК се екстрахира два пъти с фенол-хлороформ, утаява се с изопропанол и се суспендира отново в дестилирана вода. Утаената ДНК се амплифицира чрез PCR. Относителните количества PCR продукт бяха измерени, като се използва системата CFX96 в реално време (Bio-Rad Laboratories Inc.) Последователностите на праймерите, които бяха използвани за PCR, са дадени в допълнителна таблица 2.

Хроматин имунопреципитация

Уестърн петно

Анализ на ензимна активност DNMT

За пречистване на ядрени екстракти, клетките се събират в хипотоничен буфер (50 mM KCl, 25 mM HEPES (рН 7,8), коктейл за инхибитор на протеаза (GeneDEPOT, P3100)) с 0,5% NP-40. Събраните клетки се инкубират върху лед в продължение на 10 минути и се промиват два пъти с хипотоничен буфер без NP-40. След отстраняване на супернатанта, пелетите бяха ресуспендирани с буфер за екстракция на ядрото (500 mM KCl, 10% глицерол, 25 mM HEPES (рН 7.8), коктейл от инхибитор на протеаза) и инкубирани в продължение на 5 минути. Супернатантата се събира за оценка на ядрения протеин след центрофугиране. Анализът на ензимната активност DNMT се извършва с помощта на комплект за анализ на активност/инхибиране на ДНК метилтрансфераза EpiQuik (Epigentek Group Inc., P-3001) с ядрен екстракт.

Пречистване и характеризиране на R2-свързващия протеин

Статистически анализ

Всички резултати са представени като средно ± sem Статистическата значимост е оценена чрез двустранен t-тест на Student с помощта на GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software). Няма разлика в дисперсиите за всички сравнения във F-теста. Когато клетките бяха използвани за експерименти, бяха избрани три повторения на група. Всички n стойности, определени в легендите, се отнасят до биологични повторения, освен ако не е посочено друго. В експерименти с мишки, изискващи техническа манипулация, бяха използвани поне пет мишки на група. Ако са възникнали технически неизправности като неуспех на орален сондаж и интраперитонеално инжектиране, тези проби се изключват от крайния анализ. Разликите се считат за статистически значими за P