елементи

абстрактно

Интересното е, че aS и a70 изглежда разпознават много подобни промоторни последователности 6. В резултат на това няколко промотора се разпознават с подобна сила както от EσS, така и от Eσ70 in vitro 7, а тяхното преференциално разпознаване от една форма на РНК полимераза in vivo се медиира от помощни регулаторни протеини 6. Селективното разпознаване на промотора или чрез 70, или чрез oS може да бъде постигнато чрез отклонения от общата консенсусна последователност 6, 8, което придава специфичност за един фактор σ: например наличието на С нуклеотид (-13C) непосредствено преди −10 промотор Този елемент е известен определящ фактор за σ свързване S a е обща характеристика в σ S 9-зависими промотори. В предишна работа се фокусирахме върху определянето на промоторите, които са преференциално свързани in vitro от Eσ 70 или Eσ S, като се използва микрочип (RCA); потвърдихме важността на секвенционните елементи, важни за разпознаването на σS промотора, като наличието на C остатъци в позиции -13 и -12 C елемент, и предположихме, че A/T-богат дискриминационен регион би насърчил започването на транскрипция на Eσ S in vitro 10 .

В тази работа използвахме хроматин-имунопреципитационно секвениране (ChIP-seq), за да идентифицираме Eσ S-свързани промотори в ранната стационарна фаза, т.е. в момента, когато σS се натрупва вътре в бактериалната клетка. Нашите резултати доведоха до идентифицирането на нови σS-зависими гени и предоставиха представа за регулирането на некодиращите РНК от σS. Можем също така да покажем, че значителна подгрупа от EσS-свързани промотори управляват гени, чиято експресия е независима от S-S, което предполага значително припокриване в разпознаването на промотора от различни σ фактори.

резултатът

Изграждане на MG1655-rpoS His6 и имунопреципитация на aS-His6

чрез

A. Криви на растеж в LB среда от щамове MG1655 (кръгове) и MG1655- rpoS His6 (диаманти). Вътреклетъчното количество на aS (за MG1655) и aS-His6 (за MG1655-rpoS His6), определено чрез Western blot в началото на стационарната фаза (точки 1 и 2 на графиката), е показано във вмъкването. Б. Специфична активност на HPII каталаза в MG1655, MG1655- rpoS His6 и в щамове MG1655A rpoS. Стойности от три независими експеримента бяха анализирани от ANOVA; буквите показват проби, показващи статистически значими разлики. ° С. Определяне на относителното представяне на dps промоторната област в имунопреципитираната (IP) версия на входната проба чрез RT-PCR. Данните са средната стойност на две повторения с еднакви резултати.

Изображение в пълен размер

Хроматиново имунопреципитационно секвениране (ChIP-seq)

Маса в пълен размер

Сините профили показват профилите на IP плътност и входни маркери за известните гени osmB, dps, osmE и csrA ( A ) в зависимост от rpoS и за локуси, свързани с некодиращи РНК sibC/ibsC, ryeA/ryeB и omrA/omrB ( Б. ). Червените профили показват сигнала log2 за проверка на стойностите за оценка на обогатяването, получени чрез spp (пикове) за същите гени и некодиращи РНК. Стойностите по оста X са геномните координати на върховете; е показано представяне на съответните гени/интергенни региони, получени от Ecocyc (ecocyc.org).

Изображение в пълен размер

По-голямата част (63 от 78) от oS-IP пиковете са разположени непосредствено преди кодиращите последователности или известни регулаторни РНК, в съответствие с aS свързване към промоторните области. От тези 63 пика, 61 са разположени в междугенни региони, докато двата пика се намират в ORFs stfR и wbbH, но съответно нагоре по веригата, гените tfaS и wbbI, което предполага, че те могат да определят вътрешни промотори в опероните. Останалите пикове попадат в интрагенните региони на значително разстояние от другите ORF (изброени в допълнителна таблица S2). Въпреки че е възможно някои от тези пикове да определят добросъвестни места за свързване на Eσ S (напр. Промотори за все още неизвестни антисенс РНК), те не са взети под внимание за по-нататъшно характеризиране в това проучване. Въпреки това, дори ако приемем, че всички интрагенни пикове са ChIP-seq артефакти, полученият процент на фалшиво положителни резултати (19%) пак ще бъде по-нисък от този, докладван за подобни изследвания 13 .

50 от 63 пика, съответстващи на известни или предполагаеми промоторни региони, могат да бъдат уникално присвоени на един специфичен ген въз основа на ДНК последователността, покрита от пика, посоката на транскрипция на съседните гени, разстоянието до най-близките ORF и ако експериментално определената транскрипция начална площадка в границите връх. От 50-те недвусмислено идентифицирани гена, 27 бяха показани поне частично rpoS-зависими в предишни доклади, както е показано в Таблица 1. За разлика от тях, 13 пика, изброени в Таблица 2, лежат в междугенните области между дивергентно транскрибирани гени или оперони. И не могат да бъдат свързани с определен ген. Често обаче откривахме, че един от двата разнопосочни гена (или дори двата, както в интергенния регион dsrB-yodD, Таблица 2) по-рано е описан като rpoS-зависим, което предполага, че свързването на EσS се дължи на наличието на rpoS- зависим промотор в интергенната област. Като пример, ние присвоихме предполагаемото място за свързване на EσS в интергенния регион osmE-nadE на osmE, тъй като неговият промотор зависи от aS-14, 15, 16 (фиг. 2 и таблица 2).

Маса в пълен размер

Като цяло, пиковете, идентифицирани в експеримента с ChIP-seq, се припокриват с промоторите на 36 гена, за които е показано, че са поне частично зависими от rpoS (подчертани в таблици 1 и 2). Стресозависимите стресови гени определят най-известната функционална категория в нашия анализ на ChIP-seq (вж. Таблици 1, 2), в съответствие с ролята на σ S като основен регулатор на общата реакция на стрес. Интересното е, че местата за свързване на EσS също са открити нагоре по веригата от няколко гена, участващи в структурата на клетъчната обвивка (erfK, lpp, ynhG) и биогенезата на липополизахаридите (LPS) (lpxC, wbbH, wbbI), което предполага, че Eσ S може да е от значение за експресията. гени на клетъчната повърхност в отговор на спиране на растежа.

Маса в пълен размер

Повечето от интергенните региони, които не са свързани с rpoS-зависими гени, включват известни или предполагаеми промотори, разпознати от Eσ 70, в съответствие с предишни резултати, които предполагат широко кръстосано разпознаване между EσS и Eσ 70 по правила 7, 9. Интересното е, че други промотори се разпознават и от други алтернативни фактори σ, а именно σE (ytfJ и lpxP) и σH (hepA, sdaA, raiA и rpmE) (Таблици 1, 2,).

Маса в пълен размер

Експресия in vivo на гени, идентифицирани чрез ChIP-seq анализ

Резултатите от qRT-PCR експериментите (Фиг. 3) могат да демонстрират rpoS-зависима генна експресия за dps, ycgB, ybiI и ydbK, което предполага, че последните две от тях са все още неидентифицирани членове на rpoS регулона. За разлика от това, експресията на останалите гени не е повлияна от дефицита на функционалния rpoS ген, поне при тестваните условия. За по-нататъшно изследване дали тези гени показват някаква oS зависимост, тествахме нивата на тяхната експресия в rpoS-супресивен щам (MG1655/pBADrpoS), отглеждан до ранна стационарна фаза в LB среда, допълнена с 0,1% арабиноза. Въпреки че вътреклетъчните количества на aS са били почти 10 пъти по-високи при щамове, носещи pBADrpoS, в сравнение с MG1655, не са открити значителни промени в относителните нива на експресия за нито един от тестваните гени (данните не са показани).

A. Изследвания за забавяне на гела, проведени в предизвикан от хепарин K-глутаматен буфер. Б. Тестове за реактивност на KMnO 4: И двете RNA полимеразни форми на EσS и Eσ70 бяха тествани при 50 nM. За всеки панел първата лента е маркерът за молекулно тегло, получен като G + A последователна реакция на ДНК фрагмента. ° С. Последователност на новоидентифицирани bsmA, ybiI и ydbK промотори. Последователностите са изброени от позиция -17 до +10 според началния сайт на транскрипцията (TSS), маркиран "+1" и обозначен с удебелен шрифт. Елементът на промотора -10 е подчертан. KMn04-реактивни тимидинови остатъци в матричната верига (маркирани с 32P), реактивни в тестове KMn04, са посочени в получер шрифт.

Изображение в пълен размер

Регулиране на некодиращи РНК чрез Eσ S

A. Северна петна хибридизация. РНК се екстрахира в началото на стационарната фаза (OD600nm 3) от бактерии, отглеждани в LB при 28 ° C или 37 ° C и се изследва за нивата на транскрипт SibC, OmrA и RyeA (отляво надясно). Числата от дясната страна на всеки панел показват размера на съответната ncRNA. Геловете бяха изследвани за желаните гени, след това сондата беше отстранена чрез измиване и геловете бяха повторно изследвани за 5S РНК, която беше използвана като вътрешен контрол. Б. Относителна флуоресценция на транскрипционни сливания на промоторите omrA и omrB към GFP репортерния ген. Активността на промотора (плътна линия) се изразява като съотношение между флуоресценцията и абсорбцията на културата (пунктирана линия) след корекция на фона (RFU/OD600 nm). ° С. Ефекти на заместването -12С върху Т нуклеотида в промоторната област на omrA. Данните са взети от култури за една нощ и са средно за четири независими експеримента.

Изображение в пълен размер

Анализ на последователността на S-S-свързани промотори

Weblogo 3 (//weblogo.threeplusone.com/) представяне на подравнявания на последователности за експериментално идентифицирани промотори, разположени в места за свързване на Eσ S - 10 области от σS-зависими гени (горен панел) или σS-независими гени (долен панел) бяха подравнени както следва, че първият нуклеотид -10 от хексамера е настроен на позиция -12. Промоторните последователности са изброени в Таблица S3.

Изображение в пълен размер

дискусия

Маса в пълен размер

Изглежда също, че кръстосаното разпознаване на oS промотора се разпростира върху алтернативните фактори σE и σH (таблици 1, 2,) в съответствие с предишни резултати, които показват сходни функции на регулаторите rpoE и rpoS, а някои промотори се припокриват между двата σ. ин витро фактори 10, 34. Всъщност нашите резултати потвърждават силно взаимодействие между aS и aH, тъй като промоторът на rpoH се разпознава директно от EσS (Таблица 1), в съответствие с неговия rpoS-зависим израз 35. Нашите резултати биха били в съответствие с последните доклади, показващи съвместна регулация на rpoE, rpoH и rpoS регулони в отговор на осмотичен стрес при ентеропатогенна Е. coli O157: H7 36 и обширен анализ на σ факторната мрежа в Е. coli, показващ значително припокриване в разпознаването на промотора от алтернативата σ е 33 .

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

Докато реакциите на стрес са добре известни примери за генни функции, свързани с rpoS регулон, нашите резултати предполагат пряко участие на oS в експресията на гени, участващи в биогенезата и структурата на LPS и протеините на външната мембрана (Таблици 1, 2,). Известно е, че промените в структурата на клетъчната повърхност и техния състав се извършват в неподвижна фаза 38. Според нашите резултати, в допълнение към гените LPS Eσ S, ChIP-seq се свързва и с промотора lpp, кодирайки Lpp или Braun липопротеин, който свързва външната мембрана с пептидогликана и е най-разпространеният липопротеин, свързан с външната мембрана в E . coli 21. Въпреки че lpp експресията на гена е независима от rpoS гена (Фиг. 3), асоциацията на rpoS гена с Braun липопротеинова функция се препоръчва допълнително чрез идентифициране на две допълнителни места за свързване на EσS пред гените erfK и ynhG, кодиращи две от четирите алтернативни транспептидази тази омрежена връзка Lpp към пептидогликан. И двата erfK и ynhG гена са описани като rpoS-зависими 15, 16. По този начин изглежда, че при навлизане в стационарната фаза на растеж, rpoS може да се наложи да поддържа Lpp-транспептидазна активност в периплазматичното пространство.

Маса в пълен размер

И накрая, нашите резултати сочат към пряка роля на Eσ S за фина настройка на регулирането на некодиращи РНК: например, Eσ S насърчава транскрипцията на omrA, но не и на граничния ген, omrB (фиг. 5). И двата гена кодират много сходни некодиращи РНК, които са насочени към едни и същи гени. Изглежда, че различна зависимост от EσS от тези два промотора може да се развие, за да позволи диференциална експресия на некодиращи РНК на OmrA и OmrB в отговор на различни сигнали, като OmrA се индуцира като част от rpoS регулона. Резултатите от мутагенеза в позиция -12 на промотора на omrA силно подсилват схващането, че нуклеотид -12С може да повлияе благоприятно на започване на транскрипция на Eσ S при няколко промотора 39. Тъй като както OmrA, така и OmrB РНК влияят върху транслацията на няколко протеини на външната мембрана и извънклетъчни структури, като curli и flagella 40, тяхната селективна регулация може да медиира ефекта на Eσ S върху тези структури, допринасяйки за общата реорганизация на бактериалната клетъчна повърхност в отговор. към стационарната фаза.

методи

Напрежна конструкция

имунопреципитация на s-His6

ДНК от необработена MG1655-rpoS His6 се обработва с ултразвук и 200 μl се използва като контрола в секвениращите реакции (Вход = неимунопреципитирана ДНК). Входните и имунопреципитирани ДНК проби бяха анализирани с помощта на Agilent Bioanalyzer с помощта на ДНК комплект с висока чувствителност (Agilent Technologies). Пет IP проби се обединяват в една и съща колона за пречистване на ДНК (minElute, QIAGEN), за да се получат 5 ng обща ДНК, което е минималното количество за приготвяне на библиотека от последователности. Направени са два комплекта IP ДНК. Преди изграждането на библиотеките с последователности, беше извършена количествена обратна транскриптаза в реално време (qRT-PCR), за да се определи обогатяването на rpoS-зависимия промоторен регион на dps гена в имунопреципитираните проби в сравнение с входната проба. Последователностите на праймерите, използвани за qRT-PCR, са изброени в Допълнителна таблица S1.

Процедура за подготовка и последователност на библиотеката

Библиотеките на Illumina се приготвят или от 5 ng от всеки от двата пула имунопреципитирана ДНК (RpoS-IP), или от 5 ng от две контролни ДНК (вход), съгласно комплекта за подготовка на проби за ДНК на Illumina TruSeq ChIP-seq; след това всяка библиотека беше секвенирана в едноверижния 51 bp Illumin път на GAIIx секвенсор. Суровите данни са публично достъпни в архива Sequence Reads под номер за присъединяване BioProject SRP041323; BioSample SRS595203; Експеримент SRX523029; Run1 SRR1265068; Run2 SRR1271103.

Статистически и биоинформатичен анализ на данни

Суровите числа бяха картографирани спрямо генома на Escherichia coli MG1655, като се използва Bowtie 45 с нулево несъответствие. Получените BAM файлове бяха обработени с помощта на SAMtools 46 и BEDTools 47. Качеството на всяка секвенирана проба се проверява, като се използва анализ на кръстосана корелация, реализиран в пакет spp R 48. ChIP-seq връх повикване е направено с помощта на CisGenome 12 чрез съхраняване на стандартни параметри. Входните данни (контролна ДНК) бяха използвани за моделиране на фонов шум.

Определяне на rpoS-зависима генна експресия in vivo

За всички експерименти с генна експресия, бактериални щамове се отглеждат в LB среда до OD600nm = 3.0.За qRT-PCR се извлича РНК и се извършват експерименти, както е описано по-горе, като се използва 16S РНК като референция. Праймерите, използвани в qRT-PCR експериментите, са изброени в Допълнителна таблица S1. За Northern blots общата РНК се екстрахира с горещ фенол, за да се запазят малки молекули на РНК. 5 до 20 μg РНК се отделят върху 6% денатуриращ акриламиден гел преди електротрансфер в найлонова мембрана. Като генно-специфични сонди, 5'-биотинилирани олигомери (Допълнителна таблица S1) при 1 nM се използват в комбинация с 20 pM 5S РНК сонди като вътрешен контрол. Насищането и хибридизацията бяха извършени с ULTRAhyb®-олиго буфер (Ambion) при 45 ° C и сигналите бяха открити с помощта на модул за откриване на нуклеинова киселина Chemi (Thermo Scientific Pierce). GFP репортерните анализи се извършват, както е описано по-горе 50 .

РНК полимераза in vitro

Разтварянето на РНК полимераза, гел промяна и KMnO 4 реактивност се извършват, както е описано по-горе 32. 32 Р-маркирана ДНК се получава чрез PCR след 5'-фосфорилиране на праймер, допълващ кодиращата верига (вж. Допълнителна таблица S1), за да се генерират линейни ДНК парчета с приблизително 250 bp, обикновено съдържащи първите 10 кодона на гена и 220 bp на ДНК нагоре по веригата, включително промоторния регион. За тестове за промяна на подвижността на гела (GMSA), комплекси между възстановена РНК полимераза (18-150 пМ) и ДНК (1 пМ) се образуват в продължение на 15 минути при 37 ° С в буфер K-glu100 (40 mM HEPES, рН 8.0, 10.10) тМ магнезиев хлорид, 100 тМ калиев глутамат, 4 тМ дитиотреитол (DTT) и 500 ug/ml говежди серумен албумин) в краен реакционен обем от 10 ul. Реакционната смес се зарежда върху 5% естествен полиакриламиден гел след добавяне на 2,5 μl обогатен с хепарин буфер за зареждане 32 и гел електрофорезата се извършва в 0,5xTBE буфер при 120 V. Експериментите се извършват поне два пъти и дават много сходни резултати.

За тестове за реактивност KMnO 4, 50 пМ от всяка форма на РНК полимераза (EσS и Eσ 70) се инкубират с приблизително 3 пМ белязана промоторна ДНК в продължение на 20 минути при 37 ° С в буфер K-glu100 без DTT, за да се образува комплекс. KMnO4 беше добавен до крайна концентрация от 10 тМ и реакцията беше спряна след 30 секунди чрез добавяне на 2 тМ DTT. Пробите се екстрахират с фенол и се утаяват, обработват се с 1 тМ пиперидин, ресуспендират в чисто синьо формамидно синьо преди зареждане върху 7% полиакриламиден денатуриращ гел. ДНК стълба е генерирана за всеки маркиран ДНК фрагмент чрез частично G/A секвениране, използвайки мравчена киселина и пиперидин.

Други методи

Определянето на активността на HPII каталаза и експериментите с Western blot се извършва, както е описано по-горе 51, 52. Мутагенезата на omrA промотора се извършва чрез генериране на PCR продукти с мутагенни праймери, които носят желаните замествания, както е описано по-горе. .

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Peano, C. et al. Характеризиране на ядрения регулон на Escherichia coli σ S чрез анализ на хроматиново имунопреципитационно секвениране (ChIP-seq) Sci. Представител. 5, 10469; doi: 10.1038/srep10469 (2015).

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителна информация

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.