елементи

абстрактно

В нашето проучване брахиподиум дистахион, малка едногодишна трева с глобулини, се използва за съхранение на семена като първични запаси от протеини, за да се анализира токсичната природа на протеините, съхраняващи непроламинови семена, свързани с целиакия. Основните протеини за съхранение на B. distachyon са 7S протеини от глобулинов тип и 11S, 12S глобулини за съхранение на семена, подобни на овес и ориз. Бяха проведени имуноблот анализи, използващи серумни проби от пациенти с цьолиакия, последвани от идентифициране на имунно-реагиращи протеини чрез мас спектрометрия. Като контроли бяха използвани серумни проби от пациенти с целиакия на диета без глутен от пациенти с болест на Crohn и здрави индивиди. Идентифицираните протеини с интензивна серумна IgA реактивност принадлежат към фамилията 7S и 11–12S семенни глобулини. Структурните прогнози и анализите за прогнозиране на епитопи потвърждават наличието на линейни В-клетъчни епитопи, свързани с целиакия, и наличие на пептидни региони със силни HLA-DQ8 и DQ2 свързващи способности. Тези резултати показват, че както представянето на MHC-II, така и B-клетъчният отговор могат да се развият не само за проламините, но и за глобулините за съхранение на семена. Това е първото проучване на брахиподиевите протеини за съхранение на семена от непроламинов тип по отношение на целиакия.

Счита се, че имунореактивните пептиди от проламинови протеини за съхранение на зърнени видове, като пшеница, ръж и ечемик, предизвикват молекули в развитието на целиакия (CD), системно автоимунно заболяване, причиняващо атрофия на вили в тънките черва. Целиакията има силен генетичен компонент и се среща само при индивиди, носещи хаплотипове на човешки левкоцитен антиген (HLA) DQ2.5, DQ8 или DQ2.2, които действат като рецептори на клетъчната повърхност за токсични пептиди върху антиген представящата клетка. Дезамидирането на пептидите на пшеничен глиадин от стомашна киселина или определени ензими (напр. Главният автоантиген на целиакия, трансглутаминаза тип 2) силно засилва техните имуногенни свойства, като ги ангажира правилно в DQ2 и DQ8 свързващите канали. Антителата срещу тези дезаминирани глиадин пептидни (DGP) антитела имат по-висока диагностична стойност от конвенционалните анти-глиадинови антитела (AGA) 1, 2. Единственото ефективно лечение днес е диета без глутен през целия живот, която често е богата на ориз, царевица, киноа, теф или амарант. Обща характеристика на тези пълнозърнести храни е, че техните семена са богати на глобулини за съхранение, вместо на протеини за съхранение на проламин.

Материали и методи

Пациенти и серуми

Серумни проби от пациенти с целиакия с известни HLA-DQ хаплотипове и положителни за антитела срещу цьолиакия към приема на глутен (n = 13, 8 жени, 5 мъже), средна възраст 5, 7 години, диапазон 1, 4–13, 5 години) Серум проби от пациенти с целиакия на строга безглутенова диета (GFD), водеща до нормализирани антитела (анти-трансглутаминаза IgA 200 U/l) 11, 12. Шестима пациенти с целиакия са HLA DQ2, 5 хомозиготни; пет са DQ8 хомозиготни и един хетерозиготен (DQ8/X). Точният резултат от въвеждането на DQ не беше наличен в един случай. Един случай на DQ8 развива захарен диабет тип 1 две години след диагностицирането на цьолиакия. Родителите предоставиха информирано писмено съгласие за вземане на проби от серум. Всички методи за набиране, събиране на данни и експерименти бяха извършени в съответствие със съответните насоки и разпоредби. Всички експерименти бяха одобрени от комисията по етика на детската болница Heim Pál, Будапеща и от регионалния и институционален комитет на университета Semmelweis и етиката на изследванията. Взети са серумни проби по време на диагностичната процедура за целиакия за клинични изпитвания на целиакия антитела съгласно насоките на ESPGHAN и по-късно използвани за експерименти, одобрени от Комитета по етика на детска болница Heim Pal, Будапеща.

Протеинови екстракции

Общият протеин от 50 mg счукани Bd21 семена, свързани с B. distachyon, се извлича съгласно протокола на Dupont et al. Накратко, SDS-Tris екстракционен буфер (pH 6, 8), съдържащ 2% SDS, 10% глицерол, 50 mM DTT и 40 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8 е използван за извличане на общия протеин при стайна температура в продължение на един час с редовно нежен вихър. Екстрактът се центрофугира при 16 000 g в продължение на 15 минути. Супернатантата се утаява с четири обема ледено студен ацетон. В процеса на екстракция бяха използвани пет биологични повторения.

2D гел електрофореза и имуноблотинг

След утаяване, гранулата се разтваря с IEF буфер (8 М урея, 2% CHAPS, 100 mM DTT, 0,2% СА и 0,1% бромофенолно синьо). Изоелектричното фокусиране беше извършено в 7 cm Immobiline DryStrips pH 3 - 10 (GE Healthcare) при условия на рехидратация през нощта с 200 μg протеин в 150 μl IEF буфер. 12% полиакриламидни гелове бяха използвани за разделяне на протеини въз основа на тяхното молекулно тегло. 2D GE е произведен в три технически копия. Тъй като всички 2D протеинови модели от различни биологични и технически реплики са идентични, крайният онлайн нано-LC-MS/MS е приготвен от три технически 2D GE реплики и петната са обединени.

След като 2D GE протеини бяха прехвърлени в ImmobilonP PVDF мембрана (Millipore, Billerica, САЩ) и блокирани за 1 час с 5% BSA и 0,05% TWEEN20, последвано от инкубация за една нощ при 4 ° С с 1:20 разреден кръвен серум. Имунно-реактивни протеини бяха открити с анти-човешко IgA пероксидазно конюгирано антитяло, произведено в кози (Sigma-Aldrich-A0295) в присъствието на хромогенния пероксидазен субстрат 4-хлоро-1-нафтол. Протеиновите петна с имунна реакция бяха изрязани и изпратени за идентифициране на протеини чрез онлайн нано-LC-MS/MS. Оризово глутелиново антитяло, съчетано с анти-заешки IgA като вторично антитяло, беше използвано при 2D Western blot анализ, за ​​да се потвърди наличието на глобулини, съхраняващи семена 14 .

Идентифициране на протеини онлайн нано-LC-MS/MS

Анализ на последователността и прогнозиране на епитопите

резултатът

съхранение

( A ) - 2D гел електрофореза на общ протеинов екстракт от инбредната линия Bd21. Протеините се разделят на 3 до 10 рН IPG ленти, последвано от разделяне на 12% акриламидни гелове. Маркираните протеинови петна представляват имунореактивни протеини и са представени за онлайн nanoLC-MS/MS анализи. Диапазонът на молекулните тегла е отбелязан вляво. ( Б. до F ) - Представителни имуноблоти, използващи серум с IgA реактивност при лечението на пациенти без целиакия ( Б. - HLA DQ2, ° С - HLA DQ8, д - HLA DQ8/X), лечение на болест на илеокол при наивен пациент с болест на Crohn ( Е. ), HLA Пациент с цьолиакия DQ2 на безглутенова диета и здравословен контрол G ). З.- Western blot анализът на общия протеинов екстракт се извършва с използване на оризови глутелинови антитела 12 и анти-заешки IgA (Sigma-Aldrich) като вторично антитяло.

Изображение в пълен размер

Маса в пълен размер

Две точки от 7S глобулини (Uniprot ID I1GPS5 и I1GMC8) бяха идентифицирани предимно от обектите. I1GPS5 беше признат за основен хит на 14 протеинови петна. Този протеин показва най-голямо сходство с хомолозите на пшеничните резервоарни протеини Globulin-3 и Globulin-3A (Uniprot ID B7U6L4 и I6QQ39). I1GMC8 е идентифициран в две протеинови петна и показва най-голямо сходство на последователността с протеина от типа Globulin 1S, идентифициран от Triticum urartu (M7ZQM3). Протеинът брахиподиум I1HNH9 показва най-висока хомология с 11S глобулин (A. sativa Q38780). Протеините I1HMK7 и I1IPF2 бяха идентифицирани като 12S глобулини, с най-голяма прилика с 12S протеините за съхранение на семена в A. sativa (P12615 и P14812). Серумите най-често реагираха на хомолога на резервоара за пшеничен протеин Globulin-3A (69, 23% - I1GPS5) и глобулини от тип 11S и 12S (76, 92% - I1HNH9 и I1HMK7). Глутеновият хомолог с ниско молекулно тегло (69, 23% I1HMR6) също е силно имунно реагиращ на серуми от пациенти с целиакия.

За да се демонстрира присъствието на глобулини за съхранение на семена в имунореактивни протеинови петна, беше извършен Western blot анализ с използване на първични антитела, специфични за оризовите глутелини, хомолози на глобулини за съхранение на семена от ориз 11S (фиг. 1Н). Силни глобулинови сигнали бяха открити от протеинови места ID 1 до 14 и 22 до 28.

Най-важните глобулинови попадения (I1GPS5, I1GMC8, I1HMK7, I1IPF2I1HNH9), както и най-често идентифицираният проламинов протеин (I1HRM6) бяха подложени на структурно прогнозиране чрез in-silico анализ. Два съседни домена на cupin-1, характерни за 7S и 11S - 12S глобулини за съхранение на семена, бяха открити при всички попадения на брахиподиум глобулин (фиг. 2). В повечето от анализираните глобулинови протеини бяха открити региони с възможни способности за свързване със структурираните протеинови партньори 22. Силни свързващи области бяха открити на границата на подредени области на разстройство в глобулини от 7S тип (I1GPS5 и I1GMC8), докато значително по-слаби свързващи области бяха открити в 11S и 12S глобулини и не беше открит свързващ регион в анализирания брахиподиев проламин. последователност. (Фиг. 2)

Изображение в пълен размер

Десет аминокиселинни дълги пептиди с повече от 70% хомология на последователността спрямо специфични за В-клетките линейни глутенови епитопи бяха идентифицирани в непосредствена близост до свързващите области на протеина I1GPS5 (Таблица 2). Идентифицираните епитопни хомолози са пептиди с polyQ области и са разположени в две области на богатия на глутамин протеин. След това, шест остатъчен дълъг пептид (QPEQPF) беше идентифициран в 11S глобалния ген за съхранение на семена, 11HNH9. Този пептид е дезамидирана версия на известния имунореактивен AGA специфичен В-клетъчен епитоп QPQQPF (IEDB Epitope ID 147232), който е дезамидиран по време на процеса на целиакия. Тази дезамидирана версия представлява една от основните цели на серумните DGP антитела при цьолиакия. Интересното е, че нито един от хомолозите на I1HNH9 на Poaceae не съдържа този дезаминиран пептид. Не са открити хомолози на епитопи в свързаните с метаболизма протеини.

Маса в пълен размер

Изборът на предсказани свързващи агенти се извършва с помощта на горните 1% свързващи агенти въз основа на консенсусни процентилни стойности. Прогнозите бяха изчислени за всеки алел поотделно. Прогнозираните епитопи се картографират в протеинови последователности.

Изображение в пълен размер

Третичен структурен модел на 7S глобулинов мономер I1GPS5 е създаден, използвайки публично достъпни кристални структури на 7S глобулини, изолирани от растения. Идентифицираните специфични за глутен В-клетъчни епитопни хомолози, които са в последователността на приблизително 350 аминокиселинни разстояния, са картографирани в непосредствена структурна близост. Един от В-клетъчните епитопни хомолози е разположен на външната повърхност на бета-цевта, образувана от втория домейн cupin-1. Прогнозираните HLA-DQ-специфични Т-клетъчни епитопи и идентифицираният тип I диабет епитоп са разположени на противоположното място на протеиновата молекула, което също е потенциално изложено на храносмилателния ензим (Фиг. 4А, В, С). В случай на 11SHHHHHHHHHHHHHHH 11S семена, прогнозираният DQ2 епитоп е бил в заровено положение, докато хомологът на B клетъчния епитоп на QPEQPF е разположен на повърхността на протеина (Фиг. 4D и E).

Структурите на мономерните глобулини са моделирани с помощта на публично достъпни растителни ортолози като структурни шаблони и сървър за прогнозиране на структурата и функцията на протеина I-Tasser. Позициите на идентифицираните специфични за глутен В-клетъчни хомолози на епитопите и предсказаните HLA-специфични Т-клетъчни епитопи на DQ2 и DQ8 са картографирани в структурата. ( A - ° С ) I1GPS5; ( д, Е. ) 11HNH9.

Изображение в пълен размер

дискусия

Въз основа на предишните ни проучвания, голям брой зърнени протеини могат да съдържат пептиди, богати на пролин и глутамин, което ги прави мишена за свързани с целиакия антиген-представящи клетки и имуноглобулини 10, 15, 24. В пшеницата повечето от тези протеини принадлежат към суперсемейството на проламин и са естествено съединение на пшеничния глутен. Съществуват обаче и протеини от непроламинов тип, които също съдържат пептиди, идентични или силно подобни на специфичните за глутен Т-клетъчни епитопи и В-клетъчни епитопи 10, 15 .

Нашето проучване потвърди, че протеините от зърнени култури от глобулинов тип са специфично свързани с целиакия, тъй като пациентите, страдащи от други имунологични възпалителни заболявания, като болестта на Crohn, не разпознават тези протеини за съхранение на зърнени култури от типа глобулин. Неблагоприятните резултати от имуноблот анализи със серуми от пациенти с целиакия на безглутенова диета също подсилиха хипотезата, че глобулините за съхранение на семена могат да действат като вторични В-клетъчни стимуланти поради тяхната силна хомология на последователността с епитопи, получени от първични глутенови тригери. В прогресиращите стадии на заболяването вилозната атрофия и повишената чревна пропускливост допринасят защо тези протеини могат да служат като кръстосани антигени. Възстановената чревна лигавица на пациент с целиакия на строга безглутенова диета предотвратява по-доброто преминаване на погълнатите протеини и вероятно по този начин може да се контролира силна имунна реактивност.

$ config [ads_text16] не е намерен

заключения

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Gell, G. et al. Характеризиране на протеините за съхранение на глобулин от зърнени видове с нисък проламин във връзка с цьолиакия. Sci. Представител. 7, 39876; doi: 10.1038/srep39876 (2017).

Забележка на издателя: Springer Nature остава неутрален по отношение на юрисдикционните претенции на публикувани карти и институционални взаимоотношения.