grp78

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Създаване на модел на мишка с биалелна делеция на GRP78 и PTEN в черния дроб
  • Намаляването на GRP78 в черния дроб с нулев PTEN насърчава чернодробната стеатоза, увреждането на черния дроб и пролиферацията на жлъчните пътища.
  • Печен cPf/f78f/f показва повишена пролиферация, пролиферация на прогениторни клетки и реекспресия на GRP78 в клетките на жлъчните пътища.
  • Нарушение на селективните сигнални пътища в черния дроб cPf/f78f/f
  • Ускорено развитие на HCC и CC и репопулация на GRP78-положителни клетки в черния дроб cPf/f78f/f
  • дискусия
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнително изображение S1
  • Допълнително изображение S2
  • Допълнително изображение S3
  • Допълнително изображение S4
  • Допълнително изображение S5
  • Допълнително изображение S6
  • Допълнително изображение S7
  • Word документи
  • Допълнителна информация

елементи

  • Клетъчна сигнализация
  • Печен рак
  • Чернодробно заболяване
  • Туморни супресорни протеини

абстрактно

Глюкозата, регулирана от протеин 78 (GRP78), известен също като BiP/HSPA5, принадлежи към семейството HSP70. GRP78 е основен ендоплазмен ретикулум (ER) шаперонов протеин, критичен за контрола на качеството на протеините в ER, както и основен регулатор на реакцията към развития протеин. 1, 2 При натоварване с ER, GRP78 се титрува чрез натрупване на неправилно сгънати протеини, освобождавайки и активирайки разработените сензори за реакция на протеин, за да възстанови ER хомеостазата. В отговор на продължителен и тежък ER стрес, деградираният протеинов отговор предизвиква апоптотични пътища, водещи до клетъчна смърт. 3 Масовите доказателства показват, че субфракцията GRP78 се локализира на клетъчната повърхност при патологични условия, като например в раковите клетки. 2, 4 Клетъчната повърхност на GRP78 действа като мултифункционален рецептор за регулиране на сигналните пътища, като активиране на PI3K/AKT сигнализиране за оцеляване и разпространение на рака. 5, 6

Хепатоцелуларният карцином (HCC) и холангиокарциномът (CC) са най-често срещаните първични чернодробни ракови заболявания и са свързани с лоша прогноза. Понастоящем липсата на ефективно лечение на напреднал рак на черния дроб подчертава необходимостта от разбиране на туморогенните механизми на черния дроб. Супресорът на тумора, PTEN (хомолог с фосфатаза и тензон, изтрит в хромозома 10), който кодира не-излишна липидна фосфатаза от плазмената мембрана, която антагонизира сигналния път PI3K, 7 е мутирал или изтрит в 40-50% от черния дроб на човека ракови заболявания. 8 Загубата на PTEN активира пътя PI3K/AKT, което води до прогресия на рака при много видове рак при хората. Елиминирането на специфичен за черния дроб PTEN при мишки причинява увреждане на черния дроб и черния дроб, което активира прогениторните клетки да станат иницииращи тумор клетки и с течение на времето (

12 месеца) води до развитието както на HCC, така и на CC. 9, 10 Чернодробните клетки-предшественици са бипотенциални и тихо разположени в ниша на стволови клетки. По време на хронично или масивно чернодробно увреждане чернодробните клетки-предшественици се активират да се размножават и диференцират в хепатоцити и холангиоцити (клетки на жлъчните пътища). Въпреки това, дерегулираните чернодробни предшественици могат да доведат до рак на черния дроб. 11.

резултатът

Създаване на модел на мишка с биалелна делеция на GRP78 и PTEN в черния дроб

Схемата за размножаване за генериране на следните пет групи миши кохорти е показана на допълнителна фигура S1. Те включват следното: (1) единичен хомозиготен нокаут Pten с Alb-Cre (cP f/f); (2) хомозиготен нокаут Pten и хетерозиготен нокаут Grp78 с Alb-Cre (cP f/f 78 f/+); (3) хомозиготен нокаут на Pten и Grp78 с Alb-Cre (cP f/f 78 f/f); (4) прост хомозиготен нокаут на Grp78 с Alb-Cre (c78 f/f); и (5) WT, получена от носилка на животни без трансген на Alb-Cre, която служи като нормален контрол. Друг щам на мишка Alb-Cre от предишното проучване е използван в този развъден набор. Това ни позволи да проверим дали остатъчният GRP78, наблюдаван в черния дроб c78 f/f, се дължи на променливост в активността на Cre между различни трансгенни миши щамове.

Намаляването на GRP78 в черния дроб с нулев PTEN насърчава чернодробната стеатоза, увреждането на черния дроб и пролиферацията на жлъчните пътища.

В съответствие с предишни доклади, хистологичният анализ на черния дроб 9, 20 след три месеца показва леко натрупване на липиди в cP f/f и c78 f/f мишки (Фигура 2а). За разлика от това, мастните капчици са очевидни в черния дроб на cP f/f 78 f/+ и cP f/f 78 f/f (Фигура 2а). Маслено червено O оцветяване допълнително потвърждава по-тежка чернодробна стеатоза cP f/f 78 f/f (Фигура 2b). Освен това, пролиферация на жлъчните пътища беше открита в два от петте cP f/f 78 f/f черен дроб след 3 месеца (Фигура 2а). В съответствие с увеличеното натрупване на липиди, нивата на иРНК на липогенните гени SREBP-1c, ACC1 и FAS бяха увеличени в черния дроб на cP f/f 78 f/f в сравнение с WT и cP f/f мишки (Фигура 2в). Последните данни сочат, че транскрипционният фактор XBP-1 е регулатор на чернодробната липогенеза. 23 В това проучване наблюдаваме леко снаждане на Xbp-1 иРНК в черния дроб c78 f/f, в съответствие с предишни данни. Въпреки това, сплайсингът на Xbp-1 е минимален в черния дроб от cPf/f 78 f/f (Допълнителна фигура S4a). ATF4 също участва в експресията на липогенни гени; 24 обаче не открихме повишено ниво на ATF4 протеин в черния дроб cP f/f 78 f/f (Допълнителна фигура S4b).

Черен дроб cP f/f 78 f/f показва повишена пролиферация, пролиферация на прогениторни клетки и реекспресия на GRP78 в клетките на жлъчните пътища.

Увреждането на черния дроб обикновено предизвиква регенерация чрез пролиферация. 11 За да се определи чернодробната пролиферация, ние изследвахме експресията на Ki67 в черния дроб на мишки. Наблюдавахме значително увеличение на Ki67-положителни клетки в cP f/f 78 f/fv черен дроб в сравнение с cP f/fa c78 f/fv мишки на възраст 3 и 6 месеца, докато Ki67-положителни клетки липсваха в WT черен дроб (Фигура 3а). В допълнение, някои Ki67-положителни клетки с клетъчна морфология на клетъчните клетки-предшественици бяха открити около жлъчните пътища в cP f/f 78 f/f черен дроб (Фигура 3а). Маркерите на чернодробните предшественици EpCAM, CK19 и AFP също са регулирани в черния дроб cP f/f 78 f/f в сравнение с черния дроб WT, cP f/f и c78 f/f, допълнително показващи пролиферацията (Фигура 3b).

Черен дроб cP f/f 78 f/f показва повишена пролиферация, разширяване на предшествените клетки и експресия на GRP78 в клетките на жлъчните пътища. а ) Имунохистохимично оцветяване на маркера за клетъчна пролиферация Ki67 (кафяви ядра) върху черния дроб на посочените генотипове след 3 и 6 месеца. б ) Количествен PCR анализ в реално време на прогениторните маркери EpCAM, AFP и CK19 в черния дроб на посочените генотипове на 3 месеца. Експресионните нива на всеки ген са нормализирани до 18S нива на РНК. Данните са представени като средно ± se * P f/f 78 f/f. Черни стрелки а а ° С посочете примери на жлъчни пътища. Скалата показва 100 μm и е приложима за всички панели.

Изображение в пълен размер

Както се демонстрира от Western blot анализ, остатъчен GRP78 е открит в черния дроб на cP f/f 78 f/f. За да получим преглед на модела на разпределение на GRP78 при cP f/f 78 f/f мишки, ние извършихме имунохистохимично оцветяване на чернодробни секции. В съответствие с резултатите от Western blot (Фигура 1b и Допълнителна Фигура S2a), експресията на GRP78 постепенно намалява на възраст между 3 и 6 месеца. Изненадващо, разширените клетки на жлъчните пътища в cP f/f 78 f/f черния дроб показаха силно GRP78 оцветяване и на 3, и на 6 месеца (Фигура 3в). Това предполага, че някои хепатобласти с непълна Cre-медиирана рекомбинация се диференцират в жлъчните пътища, където Alb-Cre е неактивен. В допълнение, някои GRP78-положителни клетки около жлъчните пътища морфологично наподобяват чернодробни предшественици (Фигура 3в).

Нарушение на селективните сигнални пътища в черния дроб cP f/f 78 f/f

Нарушение на селективните сигнални пътища в черния дроб cP f/f 78 f/f . а ) Представителни западни петна на p-AKT (S473), общо AKT, p-ERK1/2 (T202/Y204) и общи ERK1/2 нива от черния дроб на посочените генотипове след 6 месеца. ( б ) Представителни западни петна на нива p-JNK (p54, T183/Y185) и общо JNK (p54). ( ° С ) Представителни Western блотове на експресия на β-катенин и PDGFRα. За контрол на натоварването е използван a-актин и съответните количествени показатели са показани вдясно. n = 3 за всеки генотип. Данните са представени като средно ± se * P f/f 78 f/f

Изображение в пълен размер

дискусия

Първо, защо намаляването на GRP78, комбинирано с делеция на PTEN в черния дроб, ускорява чернодробната туморогенеза, докато нокаутът на GRP78 в други тъкани обикновено инхибира образуването на тумор? Ракът на черния дроб е уникален с това, че ракът се причинява от нараняване и регенерация. Що се отнася до загубата на PTEN, ние забелязахме, че намаляването на GRP78 насърчава чернодробната стеатоза, очевидно чрез независим от XBP-1 механизъм, който води до увреждане, което индуцира пролиферация на прогениторни клетки. Ако експресията на GRP78 се елиминира в туморните клетки, развитието на тумора може да бъде спряно, както се вижда при други модели на рак. Въпреки това, в случай на чернодробна cP f/f 78 f/f, клетките на жлъчните пътища и GRP78-положителни клетки-предшественици, които са избягали от Alb-Cre, възстановяват черния дроб; следователно, развитите чернодробни тумори не са били засегнати от дефицит на GRP78. В съответствие с това обяснение е констатацията, че β-катенин-позитивните клетки репопулират β-катенин-нулевия черен дроб поради постепенната загуба на експресията на Alb-Cre. 32 и GRP78-положителни клетки бързо репопулират чревния епител при генетичен нокаут в AhCre1-Grp78. f/f мишка. 33

По отношение на произхода на HCC и CC в черния дроб cP f/f 78 f/f, HCC и CC може да са получени от чернодробни клетки-предшественици. 11 Нашите имунохистохимични данни предполагат силна експресия на GRP78 в HCC и CC тъкани и че някои клетки в близост до пролифериращи жлъчни пътища показват морфология на чернодробните клетъчни клетки-предшественици и също така експресират GRP78. Тези наблюдения предполагат възможността чернодробната клетка-предшественик да е от злокачествен произход. Интересното е, че е доказана трансдиференциация на хепатоцитите в епителните клетки на жлъчните пътища. 34 Обратно, някои жлъчни епителни клетки изглеждат способни да се диференцират в хепатоцити. Поради това ще са необходими бъдещи проучвания, за да се определи дали GRP78-положителните клетки на жлъчните пътища причиняват GRP78-позитивен рак на черния дроб.

Съобщава се за свръхекспресия на GRP78 при различни тумори, включително HCC. 36, 37 GRP78 като основен шаперон с мощни антиапоптотични свойства и регулатор на сигнала предпазва туморните клетки от ER стрес и защита на клетките гостоприемници, като по този начин насърчава растежа на тумора. Това е в съответствие с нашето наблюдение, че GRP78 е увеличен при cP f/f чернодробни тумори (допълнителна фигура S6). Съобщава се, че GRP78 защитава раковите клетки на черния дроб от ER-индуцирана апоптоза и насърчава тяхната инвазия в метастатичен модел. 37, 38 Силна експресия на GRP78 наистина може да е необходима за прогресирането на рак на черния дроб. Тъй като се разработват няколко терапевтични средства срещу GRP7813, ще бъде от интерес да се лекува рак на черния дроб с тези средства, за да се види дали те могат да блокират реекспресията на GRP78 и да потиснат прогресията на рака на черния дроб, като същевременно поддържат съществена чернодробна функция. При лечението на други видове рак с анти-GRP78 агенти, тъй като възрастният черен дроб може да функционира нормално с частично ниво на GRP78, докато ракът изисква високо ниво на GRP78, увреждането на нормалния черен дроб може да бъде ограничено. Както наскоро беше съобщено, антителата срещу клетъчната повърхност на GRP78 се понасят добре при фармакокинетични/токсикологични проучвания при мишки, маймуни и пациенти. 39, 40

Сигналният път JNK е свързан с индуциран от канцероген растеж на HCC и приблизително 50-60% от човешкия HCC показва силно активиране на JNK1. 41 Функцията на трайно активиране на JNK при смърт на хепатоцити и последващо възпаление и канцерогенеза е обобщена в различни генетични модели на мишки, развиващи HCC. 30 Нашите резултати разкриха, че p-JNK е леко повишен в черния дроб cP f/f 78 f/f след 6 месеца, придружен от повишено възпаление (данните не са показани) преди образуването на HCC и CC, което предполага, че JNK може частично да допринесе за ускоряване на черния дроб . туморогенеза. Тъй като това изисква валидиране, степента на апоптоза остава ниска (под 2%) при чернодробна cP f/f 78 f/f след 6 месеца (данните не са показани); по този начин, леко активиране на JNK в тези черни дробове не повлиява значително апоптозата, свързана с продължително активиране на JNK.