мляко

  • елементи
  • абстрактно
  • Заден план:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Основното
  • дискусия
  • методи
  • Изолация GAG
  • Бактерии и условия на отглеждане
  • Клетъчни линии
  • Определяне на жизнеспособността на клетките
  • Тест за аглутинация
  • Експерименти с клетъчна адхезия
  • Адхезия Е. coli O119 a S. fyris към клетъчни монослоеве в присъствието на GAG
  • Статистически анализ и етично одобрение
  • Отчет за финансова подкрепа
  • разкриване

елементи

абстрактно

Заден план:

Кърмените кърмачета имат по-ниска честота на остър гастроентерит поради наличието на няколко антиинфекциозни фактора в кърмата. Целта на настоящата работа е да се изследва способността на човешките млечни гликозаминогликани (GAG) да инхибират адхезията на някои често срещани патогенни бактерии.

методи:

GAGs бяха изолирани от набор от проби мляко, взети от различни майки през първия месец на лактацията. Бяха проведени експерименти за изследване на способността на GAG да инхибира адхезията на два чревни микроорганизма (ентеропатогенни Escherichia coli серотип 0119 и Salmonella fyris) към клетъчните линии Caco-2 и Int-407.

резултатите:

Изследването показа, че GAGs имат антиадхезивен ефект върху двата изследвани патогенни щама с различна степен на инхибиране. Особено в присъствието на човешко мляко GAG, адхезията на S. fyris към клетки Caco-2 и към клетките Int-407 и на двата тествани щама беше значително намалена.

заключение:

Нашите резултати показаха, че GAG в кърмата може да бъде един от важните защитни фактори срещу остри диарийни инфекции при кърмачета.

Основното

В детството различни бактерии, вируси и паразити са отговорни за стомашно-чревните инфекции. Има убедителни доказателства в подкрепа на връзката между кърменето и по-ниската честота на диария. Всъщност има няколко анти-инфекциозни средства в кърмата (секреторни антитела, лактоферин, олигозахариди и др.) (1, 2). По-специално, олигозахаридите имат няколко важни защитни, физиологични и биологични роли, включително стимулиране на растежа за полезни чревни микробиотици и инхибиране на адхезията и имунорегулацията на патогени (3, 4).

Гликозаминогликаните (GAGs) са силно сулфатирани, сложни, линейни естествени полизахариди, образувани чрез повтарящи се дизахаридни единици. Те обикновено се разделят на четири класа: хиалуронан, кератан сулфат, сулфатирани галактозаминогликани, представени от хондроитин сулфат и дерматан сулфат, носещи d-галактозамин, и сулфатирани глюкозаминогликани с хепаран сулфат и хепарин с d-глюкозамин. Всяка специфична дизахаридна единица се състои от хексозаминов остатък (галактозамин или глюкозамин), който се заменя с хексуронова киселина (глюкуронова или идуронова киселина), с изключение на галактоза, съдържаща кератанов сулфат. Сулфатните групи се естерифицират в различни позиции на въглехидратните вериги, които произвеждат структури с висока хетерогенна последователност и плътност на заряда (5).

За разлика от олигозахаридите, GAG могат да взаимодействат специфично (и конкретно) с други биологични компоненти поради наличието на голям брой сулфатни и карбоксилни групи, способни да генерират силно специфични последователности, произвеждащи силни анионни взаимодействия (5, 6, 7). В резултат на това е показано, че GAG от човешкото мляко могат да играят роля като разтворими рецептори и следователно имат способността да инхибират свързването на различни патогени с чревната лигавица, като по този начин предпазват бебето от инфекции. В допълнение, наскоро бе доказано, че хиалуронанът от човешко мляко стимулира защитна антимикробна защита при новородени (8).

След пионерски проучвания от Newburg et al. (9), наскоро беше обявена пълна количествена и качествена оценка на GAG, както по отношение на преждевременното, така и на преждевременното кърмене (10, 11). Количествено, най-високата концентрация на GAG е установена в коластрата (9, 3 и 3, 8 g/l в преждевременно и термично мляко), последвано от прогресивно намаляване до 4, 3 и 0,4 g/l в края на първия месец на лактацията. Тези данни показват, че новородените, които са кърмени, получават същото количество GAG всеки ден. От качествена гледна точка, хондроитин сулфат и хепаран сулфат/хепарин 55, съответно. 42% от общите GAG, докато дерматан сулфатът и хиалуронанът представляват останалите 3% (12).

Млечните GAG се синтезират в млечната жлеза чрез последователното действие на специфични гликозилтрансферази, свързани с протеиново "ядро" и секретирани като протеогликани. На нивото на тънките черва протеолитичните ензими, секретирани в панкреатичния сок, разцепват "сърцевината" на протеогликаните, освобождавайки GAG вериги. Тъй като чревната стена и микровилините не съдържат специфични гликозидази и сулфатази, свободните GAG остават неразградени в горната част на стомашно-чревния тракт (13), където могат да действат като разтворими рецептори и да играят противоинфекциозна роля, както е показано за човешкото мляко. олигозахариди (14).

Целта на това проучване е да се провери дали пречистеният GAG комплекс от човешко мляко е способен да инхибира адхезията на две патогенни диарийни бактерии в детска възраст, като Escherichia coli и Salmonella fyris (

Инхибиране на бактериалната адхезия към чревните клетки от гликозаминогликани (GAG). Адхезия (процент от първоначалния инокулум) на E. coli O119 и S. fyris ( а ) и Caco-2 и ( б ) на клетки Int-407 в присъствието (сиви ленти) и отсъствие (черни ленти) на GAG. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SD. Символите на фигурата показват статистически значими стойности в сравнение с контролата. * P = 0, 012. ** P = 0, 0043. † P = 0, 0412.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Стандартна светлинна микроскопия на оцветени с Giemsa клетъчни монослоеве, заразени с E. coli O119. Адхезия към монослоеве Int-407 in ( а ) отсъствие и ( б ) наличие на гликозаминогликани (GAGs): в присъствието на GAGs се наблюдава значително намаляване на адхезията на E. coli O119. Адхезия към Caco-2 монослоеве при липса ( ° С ) а ( д ) GAG: в присъствието на GAG не се наблюдава ефект на GAG върху адхезията на E. coli O119 към Caco-2 монослоеве. Увеличение = × 1000. Лента = 0,01 мм.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

дискусия

Микробната инфекция е сложен процес, до голяма степен зависи от връзката гостоприемник-микроб. Адхезията обикновено е първата стъпка, водеща до колонизация и последваща инфекция (16). Различни клетъчни компоненти на еукариотните клетки и тъкани са идентифицирани като цели за адхезията на микроорганизмите и много от тях се характеризират като протеогликани. Последните проучвания показват, че съдържащите въглехидрати молекули вместо протеини медиират бактериалното свързване с повърхността на еукариотните клетки (17). Описани са редица специфичности за свързване с въглехидрати и в някои случаи бактериалното свързване към животинските животински клетки е пряко свързано с взаимодействията с GAG (18, 19). Цялостният процес на свързване включва среща на солватиран полихидроксилиран гликан, разположен на клетъчната повърхност с място за комбиниране на солватиран протеин (адхезин), присъстващо в патогена. Силите, участващи в тази връзка, са представени чрез водородна връзка, взаимодействия на Ван дер Валс и привличане на заряд и дипол (20, 21), което предполага, че ако повърхността на гликана е допълваща към мястото на комбиниране на протеини, водата може да бъде изхвърлена и свързваща се ще се случи.

Присъстващите на повърхността рецептори се образуват от олигозахаридни остатъци от гликопротеини и гликолипиди на клетъчните мембрани. Доказано е, че адхезията към тези рецептори може да се инхибира или намали от наличието на свободни олигозахариди със структура, аналогична на структурата на клетъчните рецептори, така че патогенът да се свързва с тях, а не с клетъчната мембрана, намалявайки патогенния ефект поради (22).

Наличните до момента данни за активността на човешките млечни олигозахариди срещу Е. coli и S. fyris показват способността на фракциите, съдържащи фукозил олигозахариди, да инхибират адхезията на ентеропатогенни Е. coli O119. В допълнение, антиадхезивният ефект върху S. fyris, макар и доста слаб, се получава с киселинни и неутрални олигозахариди с ниско молекулно тегло (14).

Както вече беше демонстрирано за други човешки млечни (олиго) въглехидрати, екзогенните GAG показаха потентност като конкурентни инхибитори на бактериалната адхезия, сред които хепаринът е най-изследван (3, 23). По отношение на възможната физиологична роля на GAGs в стомашно-чревния тракт на кърмачета, важно е да се подчертае, че неразградените GAGs навлизат в тънките черва, тъй като на чревната стена няма специфични ензими, които биха могли да ги разградят. Следователно, тези молекули могат да се държат като разтворими рецептори, които имат способността да взаимодействат с патогени и да се конкурират за тяхната адхезия към чревната стена.

Това проучване потвърждава, че GAG са ефективни при инхибиране на адхезията на S. fyris към клетки Caco-2 и Int-407 и адхезията на E. coli O119 към Int-407. От друга страна, наличието на GAG не инхибира значително адхезията на Е. coli O119 към клетки Caco-2. Стойностите на адхезията за S. fyris и E. coli O119 клетки към клетки Int-407 са в съответствие със стойностите, дадени по-горе чрез сравняване на различни конфигурации на клетъчни култури като модел на чревен епител (24). Процентите на адхезия на тези бактерии намаляват, когато клетъчните суспензии се инкубират съвместно с GAG, което предполага, че GAGs могат да участват в взаимодействието на бактериално-епителните клетки.

По отношение на E. coli O119 и липсата на специфично инхибиране на адхезията към Caco-2, това явление може да се обясни с различните молекулярни структури на рецепторите, принадлежащи към двата клетъчни типа. Запасът от GAG при човешкото мляко може да е по-подобен на рецепторите Int-407, отколкото GAG, разположен на Caco-2. В допълнение, предишни проучвания предполагат, че намаленото придържане се дължи на по-ниските нива на прилепващи протеини, а не на физическото инхибиране (25, 26). Различните степени на инхибиране на адхезията към клетките Int-407 в сравнение с клетките Caco-2 също могат да отразяват произхода (ембрионален и възрастен) на двете клетъчни линии. В действителност, клетките на човешкия карцином Caco-2, често използвани за изследване на адхезията на чревни патогени към човешките клетки и цитотоксичността на ентеробактериите, са физиологично по-близки до естествените цели на патогените, тъй като ентероцитите като полярност на клетките и апикална граница 27). От друга страна, Int-407, също използван в експерименти с адхезия (28), са човешки ембрионални чревни клетки, които следователно имат възможна различна молекулна структура (и) на рецепторите в сравнение с Caco-2.

Тестваните GAG за човешко мляко са ефективни срещу S. fyris и E. coli O119, макар и с различна интензивност. Доказано е също, че GAG са ефективни при инхибиране на свързването на ХИВ с рецептора GP-120 (9). Hill et al. (8) наскоро показаха, че хиалуронанът на човешкото мляко инхибира адхезията на S. typhimurium към клетките. Горните резултати показват, че GAG от човешкото мляко имат способността да действат отделно при различни специфични рецептори. Този ефект може да бъде свързан с техния хетерогенен състав, структура и свойства на всеки отделен полизахариден компонент. Нашите текущи резултати относно способността на GAG от човешко мляко да инхибира адхезията на ентеропатогени към чревните клетки, както вече беше съобщено за олигозахаридите от човешко мляко, са допълнителна демонстрация, че антиинфекциозният ефект на човешкото мляко се дължи на наличието на биоактивни вещества (макро ) молекули, способни да предпазват новородените от патогенни бактерии на стомашно-чревно ниво.

Въз основа на тези резултати ще бъдат извършени допълнителни изследвания, като се използват различни концентрации на GAG, както и един пречистен компонент, присъстващ в сложни GAG, съдържащи човешко мляко, за да се разбере по-добре тяхната възможна физиологична роля и тяхното участие в инхибирането на механизма на бактериална адхезия.

методи

Изолация GAG

GAG за човешко мляко са получени от набор от проби, взети през първия месец на лактация и съхранявани при -20 ° C до употреба. Бяха получени и изолирани пречистени безплатни GAG, както е описано подробно (10). Накратко, отделни порции човешко мляко се обезмасляват с ацетон и след центрофугиране и изсушаване при 60 ° С, гранулата се разтваря в подходящ буфер и се третира с протеолитичен ензим. След кипене и центрофугиране в продължение на 10 минути, свободният GAG се утаява с три обема етанол. Утайката се получава чрез центрофугиране, изсушава се при 60 ° С и се пречиства на колона, пълна с анионообменна смола. Фракциите на колоната с положителна уронова киселина (29), съдържаща свободен GAG, се обединяват и допълнително се утаяват с етанол. И накрая, след центрофугиране и изсушаване, свободните пречистени комплексни GAG от човешко мляко бяха анализирани за чистота и състав и използвани за експерименти с адхезия.

Съставът на пречистените GAGs беше оценен чрез електрофореза в агарозен гел (30) и определяне на дизахариди след специфично ензимно третиране (10). Чистотата на сложните GAGs е по-висока от 85%, както се определя от теста за уронова киселина (29) с остатък, състоящ се от сол и много ниско съдържание