абстрактно

Фотоокисляването на мултивитаминни разтвори води до образуването на пероксиди. Тъй като пероксидите са свързани с чернодробна стеатоза и фиброза, както и холестаза, попитахме дали мултивитамините участват в чернодробните усложнения на парентералното хранене. Кученцата от морски свинчета бяха класифицирани като получаващи интравенозно или пълно парентерално хранене, или защитено със снимки, или контролен разтвор (5% декстроза + 0,45% NaCl), допълнен с а) мултивитамини; б) мултивитамини, защитени от светлина; в) мултивитамини без рибофлавин; или г) пероксиди (H 2 O 2, терт-бутил хидропероксид). След 4 дни беше взета чернодробна проба за хистологично изследване и нива на изопростан-F2a, маркер за радикална атака. Мултивитамините, както и общото парентерално хранене са свързани със стеатоза (резултат 0-4), тежестта на която е намалена (p + и Cu + чрез реакции на Fenton/Haber-Weiss). Радикали, получени от пероксиди, образувани в разтвори на TPN ( 12).

Целта на това проучване е да се оцени ролята на мултивитамините в свързаните с TPN чернодробни усложнения, както е документирано от хистологията, и да се отдели ефектът на светлината от ефектите на пероксидите и/или свободните радикали.

методи

Животински модел.

Под кетамин/ксилазин, 3-дневните морски свинчета (Charles River, Montreal, Quebec, Canada) бяха снабдени с 0,4 mm полиуретанов катетър (Luther Medical Products, Tustin, CA, USA) във външната югуларна вена и екстериоризирани в скапуларен регион. Катетърът е свързан с поточна система, позволяваща на животните да се движат, които са поставени отделно в пластмасови кутии с дъно от телена мрежа. Животните се държат в контролирана топла среда с 12-часов цикъл светлина/тъмнина и се хранят изключително интравенозно при 240 ml/kg/ден. След 4 дни животните бяха умъртвени и черният дроб беше аликвотиран с проби, съхранявани във форма за хистологично изследване или смлени и съхранявани при -80 ° C до анализ на триглицериди и изопростани, което е индексът на радикална атака (17). Изследването е проведено в съответствие с насоките на Институционалния комитет по животните.

Този животински модел е избран поради предишното ни непубликувано наблюдение на чернодробна стеатоза при малките морски свинчета. Същите експериментални условия трябваше да бъдат повторени, за да се провери дали тази стеатоза може да бъде предотвратена чрез фотозащита.

Протоколи.

За да се отдели ефектът от мултивитамините и светлината, животните бяха инфузирани с един от следните режими, съдържащ мултивитаминния разтвор в концентрация, подобна на тази, използвана при неонатално парентерално хранене. Фотозащитата е постигната чрез приготвяне на разтвори на тъмно и покриване на инфузионния комплект с непрозрачен материал и използване на фотозащитна интравенозна тръба (13), любезно предоставена от Baxter Canada.

MVP + светлина: 1% (v/v) MVP (Sabex, Boucherville, Квебек, Канада), незащитена от околната светлина, разредена в контролен разтвор (50 g/l декстроза + 4,5 g/l NaCl + 1 хепарин единица/ml); 5 ml MVP съдържа: витамин А, 2300 IU; витамин D, 400 IU; а-токоферол, 7 IU; витамин К, 200 μg; аскорбат, 80 mg; тиамин, 1,2 mg; рибофлавин, 1,4 mg; пиридоксин, 1,0 mg; пантотенат, 5 mg; фолат, 0, 14 mg; цианокобаламин, 1 μg; никотинамид, 17 μg; биотин, 20 μg; и добавки манитол и полисорбат като емулгатори.

MVP - светлина: 1% (v/v) MVP фотозащитен, разреден в контролен разтвор.

TPN + светлина: Два разтвора, които не са защитени от околната светлина, се вливат в аранжировка на основата на свиня близо до мястото на инфузия: а) контрол + 9,6 g/kg/d аминокиселини (Travasol, Baxter Canada, Mississauga, Ontario), Канада ) + 2% MVP при 120 ml/kg/d; б) контрол + 9,6 g/kg/d аминокиселини + 7,6 g/kg/d липиди (Intralipid 20%, Pharmacia, Peapack, NJ, САЩ) при 120 ml/kg/ден; за крайна концентрация (при 240 ml/kg/d) от 1% MVP + 4,8 g/kg/d аминокиселини + 3,8 g/kg/d липиди. Съставът на режима TPN е получен от препоръките за проучвания при възрастни морски свинчета (18).

TPN светлина (-): Същият TPN е защитен от околната светлина.

За да се оцени дали ефектите, наблюдавани при MVP и TPN, са свързани с пероксиди и/или свободни радикали, на друга група животни се дава едно от следните решения:

С (контрол): 50 g/l декстроза + 4,5 g/l NaCl + 1 хепарин единица/ml.

H 2 O 2: контрол + 200 или 500 μM H 2 O 2 (Aldrich Chemical, Милуоки, WI, САЩ) (208 ± 15 и 500 ± 20 μM).

TBH: контрол + 50 μM TBH (Aldrich Chemical) (измерено 47 ± 1).

За да се изолира ролята на рибофлавин и да се определи дали ефектите на мултивитамините са специфични за MVP, други групи животни са инфузирани с един от следните режими:

C: същото като по-горе

MVP + светлина: както е описано по-горе в протокол 1.

MVP + светлина без рибофлавин: 1% MVP, приготвен от Sabex без рибофлавин, незащитен от околната светлина и разреден в контролен разтвор.

MVI + светлина: 1% (v/v) MVI (Aventis, Страсбург, Франция), незащитена от околната светлина и разредена в контролен разтвор; 5 ml разтвор, приготвен от прах, съдържа: витамин А, 2300 IU; витамин D, 400 IU; а-токоферол, 7 IU; витамин К, 200 μg; аскорбат, 80 mg; тиамин, 1,2 mg; рибофлавин, 1,4 mg; пиридоксин, 1,0 mg; пантотенат, 5 mg; фолат, 0, 14 mg; цианокобаламин, 1 μg; никотинамид, 17 mg; биотин, 20 μg; и добавки BHA, BHT и манитол, както и полисорбати като емулгатори.

CVI + светлина: 1% (v/v) Cernevit (Baxter Канада), незащитена от околната светлина и разредена в контролен разтвор; 5 ml разтвор съдържа витамин А, 3500 IU; витамин D, 220 IU; а-токоферол, 11, 2 IU; аскорбат, 125 mg; тиамин, 3,51 mg; рибофлавин, 4, 14 mg; пиридоксин, 4,53 mg; пантотенат, 17, 25 mg; фолат, 414 μg; цианокобаламин, 6 μg; никотинамид, 46 mg; биотин, 69 μg; и гликокол, гликохолова киселина и соеви лецитинови добавки.

Хистология.

След оцветяване с хематоксилин-еозин е извършена хепатологична хистология и тежестта на стеатозата е оценена 0–4 (фиг. 1) от патолози (PB) и хепатолози (FA), които не са знаели за интравенозния режим. Резултатът показва следното: 0 = нормална чернодробна структура; 1 = наличие на видими мастни вакуоли в отделни изолирани хепатоцити; 2 = фокални промени в мазнините при хетерогенно лобуларно разпределение; 3 = дифузни промени в мазнините с редки зони без мазнини; 4 = дисперсна промяна на мазнините, без зони без мазнини.

парентерални

Чернодробна хистология (х 250), илюстрираща оценки на тежестта на стеатозата, записани от 0 до 4.

Изображение в пълен размер

Аналитични процедури.

Пероксидите се измерват по ксиленол оранжевата техника (19), както е описано по-горе. Този химичен тест, който измерва H 2 O 2, както и органични пероксиди (19, 20), се потвърждава за TPN разтвори с помощта на ензимен тест (21). Средните нива на пероксид за трите проби са MVI = 295 ± 8 μM; CVI = 358 ± 28 μM; MVP = 198 ± 14 μM; MVP фотозащита = 131 ± 10 μM; и MVP без рибофлавин = 129 ± 3 μM. Изопростан F2a се измерва с помощта на търговски ензимен имуноанализ (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Нивата на чернодробните триглицериди са измервани ензимно с помощта на търговски комплекти (Roche Diagnostics, Laval, Квебек, Канада).

Статистически анализ.

Всички резултати се отчитат като средна стойност ± SEM. Резултатите за стеатоза бяха анализирани чрез теста на Ман-Уитни за непараметрични данни. Антропометричните характеристики на животните (Таблица 1) и чернодробният F2a изопростан бяха сравнени чрез ANOVA след трансформация (естествен логаритъм), за да се осигури хомосцедастичност, определена от хи-квадрата на Бартлет. Нивото на значимост е определено на p

Ефект на парентералните мултивитамини (MVP), TPN (5% декстроза + 0,45% NaCl + аминокиселини + липиди + MVP) и експозиция на светлина (± светлина) върху (A) тежест на чернодробната стеатоза (резултат 0-4) и (B) ) чернодробен изопростан F2α. Мултивитамините и TPN са свързани със стеатоза, тежестта на която е намалена чрез фотозащита (- светлина). Фотозащитата значително намалява нивата на изопростан, което не съответства на тежестта на стеатозата, тъй като TPN индуцира значително по-високи нива на този ейкозаноиден маркер на атака на свободните радикали. Всяка колона представлява средната стойност ± SEM (брой проби). * p 2 (фиг. 3). 2 Б).

Ефект на H 2 O 2 и TBH инфузия върху (A) тежест на стеатозата и (B) чернодробен изопростан F2α. H 2 O 2 и TBH, вливани в редица концентрации, произведени в мултивитамини, не са получили резултати за чернодробна стеатоза по-високи от контролите (C = 5% декстроза + 0,45% NaCl). H 2 O 2 предизвиква окислително натоварване, тъй като има положителен ефект върху нивата на изопростан F2a. Всяка колона представлява средната стойност ± SEM (брой проби). * стр

В сравнение с контролата (C = 5% декстроза + 0,45% NaCl), фотоекспонираните (+ леки) мултивитаминни препарати (MVP, MVI, CVI) увеличават чернодробната стеатоза (резултат 0–4). Ролята на рибофлавин в ефекта на излагане на светлина беше тествана с помощта на препарат без този фоточувствителен витамин (MVP без рибофлавин). Всяка колона представлява средната стойност ± SEM (брой проби). * настолен компютър: