белия

  • елементи
  • абстрактно
  • Заден план:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Основното
  • резултатът
  • Ензастауринът инхибира растежа на човешки NSCLC клетки
  • Ензастаурин повлиява клетъчната миграция и инвазия
  • Анализ на промените в генната експресия след ензимно лечение
  • Ензастауринът инхибира експресията на гена u-PAR в клетките на NSCLC
  • нокдаунът на u-PAR ресенсибилизира NSCLC клетките и индуцира апоптоза на Enz
  • Ензастаурин in vivo намалява отдалечените метастази в NSCLC клетки
  • дискусия
  • История на промените
  • Допълнителна информация
  • Файлове на Powerpoint
  • Допълнителна фигура 1
  • Допълнителна фигура 2
  • Допълнителна фигура 3
  • Допълнителна фигура 4
  • Word документи
  • Допълнителна таблица 1
  • Допълнителна таблица 2
  • Допълнителна таблица 3
  • Допълнителни легенди за изображения

елементи

  • биомаркери
  • Генна регулация
  • Молекулно насочена терапия
  • Недребноклетъчен рак на белия дроб

Тази статия е актуализирана

абстрактно

Заден план:

Ензастаурин (Enz) е инхибитор на серин/треонин киназа, който блокира протеин киназа C (PKC) ß/AKT. Способността на това съединение да инхибира раковата инвазия и метастази не е напълно изяснена.

методи:

Способността на Enz да инхибира инвазията и метастазите и целевите молекули беше изследвана при недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC) чрез микрочипове, Matrigel и in vivo анализи на хорионалантоисна мембрана (CAM) чрез RT-PCR.

резултатите:

Ензастаурин значително намалява миграцията, инвазията и in vivo метастазите в белите дробове и черния дроб (CAM анализ) на различни клетъчни линии на NSCLC. Гени, насърчаващи прогресията на рака (u-PAR, VEGFC и HIF1α) и супресията на тумора (VHL, RASSF1 и FHIT) NSCLC са били значителни (P -1 -1) преди клетъчната реколта. В резултат установихме, че лечението с Enz може да инхибира фосфорилирането на PKC, AKT, p42/44 и GSK3β в присъствието и отсъствието на EGF (Фигура 1C, Допълнителна Фигура 1).

Ензастауринът инхибира разпространението, миграцията и инвазията на NSCLC. ( A ) NSCLC клетъчна пролиферация след лечение с Enz. Данните са изразени като процент от контролните (третирани с DMSO) клетки. Точки, средно ± sd от три експеримента. Получените IC50 стойности за Enz за всички изследвани NSCLC клетъчни линии са показани в кутията. ( Б. ) Анализ на апоптоза H460, A549, H1299 след лечение с Enz. След 48 часа лечение с Enz, клетките се скринират чрез поточна цитометрия и процентът на апоптотичните клетки се изчислява спрямо третирани с DMSO клетки. ( ° С ) Western blot анализ на клетки, третирани с EGF, Enz или комбинация от двата реагента. Специфични антитела срещу споменатите молекули бяха използвани заедно с анти-бета-актин като контролен товар. ( ° С а д ) Процент на мигриращи клетки (тест за излекуване) и инвазивни клетки (тест на Matrigel). Клетките се третират, както е описано в Материали и методи. Образците, третирани с DMSO, служат като контрола (100%), а други обработени проби са изчислени и нанесени като процент от тази стойност. * Р

Ензастаурин индуцира експресията на туморни супресорни гени. Количествено определяне ( A ) VHL, ( Б. ) RASSF1 a ( ° С ) FHIT FHIT в клетки H460 и A549 в реално време след 24-48 часа лечение с DMSO или Enz (IC50). Относителната генна експресия се нормализира спрямо β-актин иРНК. * Р

Влияние на ензастаурин върху експресията на проинвазивни гени. Количествено определяне на PCR ( A ) HIFla, ( Б. ) VEGFC и ( ° С u-PAR в клетки H460, A549 и H1299 в реално време след 24 до 48 часа лечение с DMSO или Enz (IC50). Относителната генна експресия се нормализира спрямо β-актин иРНК. * Р

Ензастаурин инхибира u-PAR промоторната активност и експресията на u-PAR протеин. ( A ) Общ u-PAR протеин, оценен чрез ELISA, както е описано в Материали и методи. Всяка стойност представлява средната стойност на трикратните измервания. ( Б. ) Определяне на активността на луциферазата за клетки H460, A549 и H1299. Данните са представени като средната стойност ± sd от три независими експеримента, извършени в четирикратни повторения. * Р

Ензастауринът инхибира метастазите в NSCLC in vivo. ( A - ° С ) Брой метастатични клетки в черния дроб и белите дробове на пилешки ембриони, третирани интравенозно с различни концентрации на Enz (2 или 4 μM) или DMSO. Човешки Alu последователности бяха амплифицирани и количествено определени чрез PCR в реално време. ** P * P  0,05.

Изображение в пълен размер

дискусия

Това проучване показва, че Enz инхибира миграцията, инвазията и in vivo метастазите в NSCLC и изследва първите механизми, допринасящи за инхибирането на индуцираната от Enz миграция, инвазия и метастази в NSCLC. Ние показваме, че Enz транскрипционно инхибира експресията на u-PAR гена, регулира надолу свързаните с прогресията на тумора молекули HIF1 α и VEGFC, а също така регулира гените VHL, RASSF1 и FHIT, потискащи тумора. Нашите открития освен това предполагат, че нокдаунът si-u-PAR/sh-u-PAR сенсибилизира устойчивите NSCLC клетки към Enz и индуцира апоптоза. Тези открития предполагат, че лечението с Enz при пациенти с NSCLC може да допринесе за повишена преживяемост чрез инхибиране на гените за прогресия на тумора и индуциране на туморни супресорни гени.

В нашата работа ние показахме, че Enz инхибира отдалечени метастази в черния дроб и белите дробове in vivo при CAM анализ. В допълнение към неговите апо-апоптотични, инхибиращи растежа и антиангиогенни свойства (Keyes et al., 2002; Graff et al., 2005; Querfeld et al., 2006; Willey et al., 2009), това може да бъде, поне в част, поради понижаване на регулацията.гени за прогресия и инвазия на тумора (u-PAR, HIF1α и VEGFC гени) и повишаване на регулацията на NSCLC супресорни гени (FHIT, RASSF1 и VHL) от Enz. Смятаме за малко вероятно основният механизъм на инхибиране на метастазите на Enz да бъде обяснен с антиангиогенеза, тъй като установихме, че DMSO- или Enz-потопени тапи не показват значителна разлика в техния ефект върху формирането на ембрионалната васкулатура на горната CAM (данните не показан). Въпреки това, антиангиогенният компонент на Enzo в контекста на антиметастатичната активност в нашия модел със сигурност не може да бъде изключен напълно.

Като цяло това е първият изчерпателен анализ за изследване на диференцирано регулирани гени в клетките на NSCLC след лечение с Enz и за включване на нови цели на Enz в контекста на миграция, инвазия и отдалечени метастази в NSCLC. Нашите резултати показват, че Enz играе основна роля в регулирането надолу на u-PAR от Sp1/Sp3 и c-Jun (AP-1), в допълнение към HIF1 a и VEGFC, които участват паралелно с туморния растеж и метастази с регулиране на супресията на тумора. от значение за NSCLC. Освен това, нокдаунът на u-PAR ресенсибилизира NSCLC клетките за лечение с Enz. Тези открития предоставят важна информация за текущи клинични изпитвания с Enz при пациенти с NSCLC и други проучвания, изследващи resz тъкан или кръвни проби от пациенти, лекувани с Enz, като разтворим в серум u-PAR или u-PAR (Henic et al, 2008), както потенциално препоръчва клинично значим маркер на резистентност към лечението.