елементи

абстрактно

Детското затлъстяване е в съответствие с увеличения брой циркулиращи класически CD14 + CD16 - и умерени CD14 + CD16 + моноцити. Моноцитите са ключови играчи в развитието и обострянето на атеросклерозата, което повдига въпроса дали моноцитозата при детското затлъстяване е допринесла за атерогенезата през годините. Тук обсъдихме профила на експресия на моноцитния ген при детско затлъстяване, използвайки платформата Illumina microarray върху сортирани моноцити от 35 деца със затлъстяване и 16 лоши контроли. Децата с наднормено тегло показаха силен профил на експресия на моноцитни гени в сравнение със слабите контроли. След валидиране с количествена PCR, ние проучихме връзката на 5-те най-добре диференцирано регулирани моноцитни гени при детско затлъстяване със затлъстяване и сложност на коронарната атеросклероза (резултат SYNTAX) в група от 351 възрастни с риск от исхемична сърдечно-съдова болест. Намаляване на регулацията на моноцитите IMPDH2 и TMEM134 при детско затлъстяване също е наблюдавано при възрастни със затлъстяване. В допълнение, понижаването на регулацията на моноцита TMEM134 е свързано с по-висок резултат от атеросклероза на SYNTAX при възрастни. В заключение, детското затлъстяване включва промени в експресията на моноцитен ген, свързани със затлъстяването и повишена сложност на коронарната атеросклероза при възрастни.

Епидемията от детско затлъстяване има тревожни сърдечно-съдови последици и по този начин ограничава световното увеличение на продължителността на живота 1, 2. Ранното затлъстяване може да допринесе за развитието на сърдечно-съдови заболявания по няколко начина. Първо, детското затлъстяване води до затлъстяване в зряла възраст, което е важен рисков фактор за сърдечно-съдови заболявания, особено висцерално затлъстяване 3, 4. Второ, затлъстяването в детска и зряла възраст споделят независими рискови фактори за сърдечно-съдови заболявания, като високо кръвно налягане 5. В допълнение, индуцирана от затлъстяване инсулинова резистентност и хипергликемия водят до дефектна инсулинова сигнализация в клетките на съдовата стена, което насърчава атеросклерозата на ниво 6 на артериалната стена. И накрая, затлъстяването е свързано с ниска степен на системно възпаление, което насърчава атерогенезата 7, 8 .

На клетъчно ниво моноцитите изглеждат ключова връзка между затлъстяването и сърдечно-съдовите заболявания. Затлъстяването е придружено от левкоцитоза, особено при миелоидни линии 7, 9. Последните проучвания показват, че възпалителните фактори, получени от мастна тъкан, като IL-1β, стимулират миелоидни предшественици на костния мозък, което води до моноцитоза при затлъстяване 10. В допълнение към увеличения брой моноцити, при затлъстяването има активиран и възпалителен фенотип. При хората моноцитите попадат в три фенотипни категории: класически CD14 + CD16-, междинен CD14 + CD16 + и некласически CD14 + CD16 + моноцити 11. По-рано показахме, че детското затлъстяване е придружено от увеличен брой и активиран фенотип на класическата CD14 + CD16 - моноцитна подгрупа 7. Тези моноцити са еквивалентни на високо GR1 + Ly6c моноцити при мишки, които се диференцират във възпалителни макрофаги и пенести клетки при различни модели на атеросклероза 12, 13. По този начин увеличеният брой възпалителни моноцити при детското затлъстяване може да допринесе за атерогенезата през годините.

Целта на това проучване е да се получи по-задълбочено разбиране на профила на експресия на моноцитния ген при затлъстяване в детска възраст в сравнение с контролите с нормално тегло, като се използват анализи на микро-масиви на сортирани моноцити. Профилите на експресия на моноцитни гени бяха допълнително сравнени с установена кохорта от 351 възрастни с риск от исхемично сърдечно-съдово заболяване, за да се определи дали профилите на експресия на моноцитни гени при детско затлъстяване се припокриват с атерогенния фенотип на моноцитите при възрастни. Кохортата за възрастни включва няколко клинични параметъра, но ние се съсредоточихме върху връзката между експресията на моноцитен ген и резултатите от атеросклероза SYNTAX, тъй като това е установена ангиографска система за оценяване на сложността на коронарните атеросклеротични лезии, която се използва широко като показания за атеросклеротичен товар., 17, 18 .

резултатът

Моноцитите при детско затлъстяване показват силен профил на генна експресия

Децата с наднормено тегло показват типични клинични и биохимични характеристики със значително по-високо стандартно отклонение на индекса на телесна маса за възраст и пол (BMI-SD) в сравнение с постните контроли (3, 4 срещу 0,4, p 109/ml срещу 0,4 x 109/ml, p + CD16 - моноцити (52,0 × 107/ml срещу 36,2 x 107/ml, p = 0,001) и по-висока средна стойност CD14 + CD16 + моноцити (4,6 x 107/ml срещу 3,3 x 107/ml, p

моноцитен

Топлинна карта и клъстерен анализ на експресията на моноцитен ген. Картата на отоплението показва структурата на генния клъстер като йерархично дърво с различни клонове и използва редове z-резултати за показване на данни, които се различават над или под средното за популацията.

Изображение в пълен размер

Количествено PCR валидиране

Количествена PCR (qPCR) е използвана за потвърждаване на резултатите от генната експресия с фокус върху първите 20 интервенции с микрочипове. QPCR анализите потвърждават наблюдаваното понижаване на регулацията на моноцитните гени Хидроксиметилбилан синтаза (HMBS) (p = 0,01), богат на левцин пентатрикопептид, съдържащ повторение (LRPPRC) (p = 0,005), трансмембранен протеин 134 (TMEM134) (p = 0,028) и Zwilch Protein Kino (ZWILCH) (p = 0,005) при детско затлъстяване в сравнение с постно управление (фиг. 2, допълнителна таблица 7). В допълнение, инозин монофосфат дехидрогеназа 2 (IMPDH2) показва тенденция към понижаване на регулацията при затлъстели моноцити (р = 0,06). Поради значителната понижена регулация на моноцитите при възрастни със затлъстяване, IMPDH2 също е включен в следващите анализи. Заедно тези 5 регулирани надолу гени формират отправна точка за последващи изследвания. Първо се изследва връзката между 5 регулирани надолу моноцитни гена и подбора на клинични променливи в детска възраст (допълнителни таблици 3 и 4). Второ, изследвана е връзката със затлъстяването и атеросклерозата при възрастни с риск от исхемична сърдечно-съдова болест.

Количествената PCR потвърждава понижаването на регулирането на 5 моноцитни гена при детско затлъстяване. Графиките показват многократната индукция на желания ген, нормализиран за генна експресия. Лентите за грешки представляват SEM.

Изображение в пълен размер

Анализ на следите

Фокусирайки се върху функционалната значимост на наблюдавания профил на генна експресия, функционалното обогатяване на диференциално експресирани гени в биологични процеси беше оценено с помощта на инструмента ToppFun, инструмент за обогатяване на термина GO. Шестдесет и четири от 67-те гена могат да бъдат идентифицирани от ToppFun и картографирани към пътища, участващи в биологични процеси, като се използва минимален размер на пътя от 10 гена. Тези гени са участвали главно в окислителното фосфорилиране и различни метаболитни процеси (Допълнителна таблица 5, Допълнителна фигура 1).

Експресия на моноцитен ген и затлъстяване при възрастни и сърдечно-съдов риск

За да се определи дали рисковите възрастни имат профил на експресия на моноцитен ген, подобен на затлъстелите деца, са проучени 5 валидирани моноцитни гена в група от 351 възрастни с риск от исхемична сърдечно-съдова болест. Клиничните характеристики на кохортата за възрастни са изброени в допълнителна таблица 8.

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

дискусия

Нашите резултати подчертават значението на моноцитозата при детското затлъстяване и повдигат няколко интересни въпроса. Първо, анализът на пътя на диференцирано регулираните моноцитни гени при детското затлъстяване разкри свръхпредставяне на окислително фосфорилиране, оксидативен стрес и вътреклетъчни метаболитни пътища, очевидно отразяващо препрограмирането за аеробна гликолиза. Докато имунните клетки в покой се нуждаят предимно от АТФ, за да отговорят на клетъчните изисквания и да използват преобразуване на глюкоза и пируват (гликолиза) и окислително фосфорилиране, за да отговорят на тези нужди, много имунни клетки във възпалителни микросреди се подлагат на метаболитно препрограмиране за аеробна гликолиза, за да се включат в клетъчния растеж и пролиферация. 23. Интересното е, че регулирането на аеробната гликолиза също съвпада с развитието на „трениран имунитет“ 24. При многократна стимулация с микробни части и/или метаболити, моноцитите се подлагат на епигенетично препрограмиране към аеробна гликолиза, което увеличава отговора на тренираните моноцити към рестимулация 23, 25. Съвременната литература предполага, че развитието на обучен имунитет допринася за развитието на системно възпаление и атеросклероза и представлява интересна цел за терапевтична намеса 25 .

Второ, ролята на TMEM134 в моноцитите придобива все по-голяма сила. При проучвания върху човешки моноцити, експресията на TMEM134 е намалена при класически CD14 + CD16- и междинни CD14 + CD16 + моноцити, за разлика от некласическите CD14 + CD16 + моноцити 26. По този начин, регулирането надолу на TMEM134 при детско затлъстяване и възрастни със сърдечно-съдов риск може да отразява CD14 + CD16 + и CD14 + CD16 + индуцирано CD14 + индуцирано затлъстяване. Необходимо е да се изясни дали силно консервираният 21.5 kDa трансмембранен протеин TMEM134 играе активна роля в диференциацията на моноцитите. Съществуващите проучвания показват, че TMEM134 засяга прототипа на сигналния път на възпалителен ядрен фактор-KB (NF-κB). TMEM 134 е идентифициран като свързващ протеин от латентен мембранен протеин 1 (LMP1) и отворена рамка за четене 2 на вируса на хепатит Е (ORF2) и е засегнат надолу по веригата NF-κB сигнализация чрез тези свързващи партньори 27, 28 Важното е, че модулацията на сигнализацията NF-κB надолу по веригата се счита за един от белезите на вроденото имунно програмиране при хронично възпаление Следователно е изкушаващо да се предположи, че наблюдаваното понижаване на регулацията на TMEM134 при моноцити при затлъстяване при деца е свързано с развитието на трениран имунитет, както беше обсъдено по-горе.

И накрая, трябва да се вземат предвид ограниченията на настоящото проучване. Тъй като популацията ни от педиатрични проучвания е сравнително малка, съобщените в нашето проучване асоциации имат фина сила. Второ, факторите на околната среда, като замразяване-размразяване на моноцити, може да са повлияли на профилите на генна експресия. Въпреки че пробите от деца и възрастни се третират по подобен начин, незначителни разлики в обработката могат да повлияят на профилите на генна експресия. Трето, решихме да се съсредоточим върху 5 моноцитни гена, потвърдени от qPCR. Следователно бихме могли да игнорираме важни моноцитни гени, които не са били включени в валидирането на qPCR. И накрая, сортирането на CD14-положителни магнитни топчета отклони анализираните моноцитни отделения към класически CD14 + CD16- и междинни CD14 + CD16 + моноцити (допълнителна фигура 2) и частично не успя да отчете некласическите CD14 + CD16 + моноцитни подмножества, което е считани за по-малко важни за развитието на атеросклероза 21, 22 .

В заключение, детското затлъстяване включва промени в експресията на моноцитни гени, свързани със затлъстяването и повишена сложност на коронарната атеросклероза при възрастни. По-специално, ролята на TMEM134 в моноцитите придобива сцепление, тъй като понижаването на регулирането на TMEM134 моноцитите е свързано със затлъстяване при деца и възрастни и съвпада във времето с по-високия резултат на атеросклероза SYNTAX при възрастни с риск от исхемично сърдечно-съдово заболяване.

методи

Детска кохорта

Мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC) са изследвани при 51 деца на възраст 6-16 години (35 затлъстели, 16 лоши контроли). Клетките са получени от публикувано преди това проучване на напречното сечение в педиатричното амбулаторно отделение в Медицински център „Меандър“ в Амерсфорт, Холандия, състоящо се от 60 деца със затлъстяване и 30 контролни групи по възраст и пол 7. Тъй като PBMCs бяха на разположение за 35 деца със затлъстяване и 16 лоши контроли, тези деца бяха включени в настоящото проучване. Важното е, че наличността на съхранени PBMC зависи от количеството кръв, дадено от пациента след записване, което се променя произволно. Следователно ние вярваме, че пациентите в настоящото проучване са рандомизирани към предишното проучване.

BMI-SD е изчислен въз основа на резултатите от Петото холандско проучване на растежа (2008-2010 г.). Детското затлъстяване се определя като BMI-SD> 2, 5, което може да бъде екстраполирано към международната дефиниция за затлъстяване като BMI> 30 kg/m2 за възрастни 30, 31. Кръвното налягане се измерва с автоматизиран осцилометричен метод (Dinamap; GE Healthcare, Amersham, UK). Липидните профили се получават при използване на стандартизирани лабораторни процедури. Получено е писмено информирано съгласие от всички деца и техните родители. Проучването е одобрено от Институционалния съвет за преглед на медицинската етика към Университетския медицински център Утрехт, Холандия. Всички експерименти с човешки биологични материали са извършени в съответствие с приложимите насоки и разпоредби.

Възрастна група

моноцити

Мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC) бяха изолирани в двете кохорти, използвайки центрофугиране с градиент на плътност на Ficoll-Paque. В педиатричната кохорта е проведено фенотипиране на поточна цитометрия в предишни проучвания 7. След изолирането пробите се съхраняват в замразяваща среда (FCS с 10% DMSO, Sigma-Aldrich) до по-нататъшна употреба. За изолиране на моноцити, съхраняваните проби се размразяват и измиват в среда, съдържаща RPMI1640, допълнена с 1-глутамат и 25 mM HEPES (Gibco), съдържащ 2% FCS и пеницилин/стрептомицин (100 U/ml) (Invitrogen). Клетките се центрофугират за 10 минути, 1600 rpm при стайна температура. След това PBMC бяха ресуспендирани в MACS буфер - 2% FBS (Biowest), 2% EDTA (VWR химикали) в PBS (Gibco) - и преброени, използвайки метода на трипан синьо изключване (Gibco). Античовешки CD14 магнитни частици, където впоследствие се използват за изолиране на моноцити, използвайки фирмен протокол (BD IMag). След това CD14 положителните клетки се суспендират отново в 500 μl TRIZOL (Life Technologies) и се съхраняват при -80 ° C.

Микрочипове и обработка на данни

РНК беше изолирана от тризолизирани AROS приложни биотехнологични проби. Проби от 35 деца със затлъстяване и 16 здрави деца с контрол и 351 възрастни са били подложени на същите изолационни процедури и са били третирани по подобен начин. Накратко, пробите бяха етикетирани с помощта на комплект за усилване на РНК на Illumina TotalPrep и 100 ng обща РНК. IVT продуктът се проверява с гел и се определя количествено с помощта на NanoDrop (Thermo Scientific). 750 ng cDNA бяха използвани за стандартния протокол Illumina, преди пробите да бъдат хибридизирани с полетата (Illumina humanHT-12 v3). Полетата бяха сканирани с помощта на Bead Array Reader (Illumina). След проверка на средната интензивност на пробите бяха взети проби със средна интензивност 33 .

qPCR Проверка

За да се валидират 67 диференциално експресирани гена, бяха проектирани праймери qPCR за топ 20 попадения. От тези двойки грундове, 17 функционираха оптимално и бяха счетени за полезни за процеса на валидиране (Допълнителна таблица 6). Налична е висококачествена РНК за 27 деца със затлъстяване и 11 здрави контроли за проучвания за потвърждаване на qPCR. QPCR анализът е извършен с помощта на SYBR Select Master Mix реагенти (Thermo Fischer Scientific) и е изпълнен с помощта на система QuantStudio Flex (Thermo Fischer Scientific). Данните бяха нормализирани за експресия на гени GUSB, 36B4 и B2M в съответствие с международните стандарти 34 .

статистика

Първо, демографските характеристики на изследваната популация бяха представени като числа и проценти за категорични променливи и като средства със стандартно отклонение (SD) или медиани с интерквартилни диапазони (Q1, Q3) за нормални и нормално разпределени непрекъснати променливи. Впоследствие бяха сравнени експресионните профили на моноцитни гени при бедни и затлъстели деца и бяха оценени значителни разлики между двете групи, използвайки тестовете на Mann Whitney U върху непрекъснати променливи и теста X2 върху бинарните променливи.

Второ, профилите за експресия на моноцитни гени бяха сравнени с помощта на пакета Limma в R. Накратко, пакетът Limma използва емпирични методи на Bays за анализ на данни от микрочипове на генна експресия и е специално проектиран да анализира по-малки масиви от данни 33. За този анализ гените функционират като изходни променливи (зависими променливи), а състоянието на затлъстяването като детерминанта (независима променлива). Възрастта и полът бяха включени в модела като ковариати. В допълнение, корекцията на Benjamini Hochberg (BH) беше използвана за настройка за множество тестове. За да се илюстрират резултатите от анализа на микрочиповете, е генерирана топлинна карта с помощта на функцията на топлинната карта.

Трето, линейна регресия се използва за изследване на връзката между състоянието на затлъстяването и експресията на гена (зависима променлива). За този анализ са изградени два модела; суров модел (модел 1) и модел, при който възрастта и полът са включени като ковариати (модел 2) (допълнителна таблица 2).

Четвърто, връзката между 5 гена, потвърдени от qPCR и клинични променливи, беше проучена в цялата педиатрична група (n = 51), както и в подгрупата със затлъстяване (n = 35) и в групата за възрастни (n = 351), като се използва линейна регресионен анализ (допълнителни таблици 3 и 4). За анализ, извършен през възрастта на детето, кохортата, полът и BMI-SD бяха включени като ковариати, докато за анализ в затлъстелата подгрупа на възрастта и пола бяха включени като ковариати. P 2-странен