доказателства

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Демография на донори на тъкани
  • GSH, GSSG, 3-NT, 3-CT и 8-оксо-dG
  • Аконитазна активност
  • 8-оксо-dG се свързва с GSH/GSSG в мозъка
  • дискусия
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна таблица 1
  • Допълнителна таблица 2

елементи

абстрактно

Аномалиите в мозъка са сред най-често регистрираните промени в мозъка на аутизма. 2, 3, 4 Проучванията за невроизобразяване съобщават за намален обем на вермис, както и общ обем на малкия мозък, докато анализите след смъртта разкриват значително намаляване на броя на клетките на Пуркине при лица с аутизъм. 5, 6, 7, 8 Доказателствата за невроимунно участие в мозъка включват наличието на активирана невроглия и повишени нива на цитокини, както и автоантитела към мозъчни протеини. 9, 10, 11

Аномалиите в извивките от по-високо време (STG) се считат за значими при аутизма, тъй като играят важна роля в обработката на звука и развитието на речта. 12 STG съдържа зоната Brodmann 22 (BA22), която в лявото полукълбо съответства на областта Wernicke, регион, участващ в обработката на речта. Невроизобразяващите анализи разкриват увеличен десен обем STG при лица с аутизъм, в съответствие с неотдавнашната констатация за по-голяма дясна асиметрия на STG при лица с аутизъм. 13, 14 При микроскопски анализ на BA22 при лица с аутизъм е отбелязано намаляване на плътността на невронните клетки и увеличаване на плътността на глиалните клетки. 15 Невроимунно активиране при STG аутизъм е съобщено в едно проучване и са установени повишени нива на транскрипти на няколко имунни гена. 16.

Биомаркери на оксидативен стрес са докладвани при много неврологични и психиатрични разстройства, включително болестта на Алцхаймер, болестта на Паркинсон, 18 шизофрения, 19, 20 биполярно разстройство 21 и алкохолизма, 22 и могат да отразяват общ основен патофизиологичен механизъм. По-рано в кръвта на деца с аутизъм са документирани многобройни показатели за оксидативен стрес, включително намалена антиоксидантна ензимна активност, повишена липидна пероксидация и натрупване на крайни продукти за напреднала гликация. 23, 24, 25 В три независими кохорти случай/контрола, деца с аутизъм са показали ненормални плазмени нива на метаболити в метаболизма на глутатион редокс метаболизма. 26, 27, 28 В тези проучвания е установено, че средната концентрация на редуциран глутатион (GSH), първичен вътреклетъчен антиоксидант и редокс буфер е значително намалена, докато окисленият глутатион дисулфид (GSSG) е значително увеличен, което води до намаляване на глутатиона съотношение редокс (GSH/GSSG) в плазмата и първичните имунни клетки от деца с аутизъм. 29 В обобщение, обобщените доказателства показват, че децата с аутизъм имат по-окислена извънклетъчна (плазма) и вътреклетъчна микросреда на имунните клетки, отколкото незасегнатите контролни деца на възраст.

Оксидативният стрес и увреждане възникват, когато антиоксидантните защитни механизми не успеят ефективно да противодействат на ендогенни или екзогенни източници на реактивни кислородни видове. Глутатионът е основният антиоксидант, отговорен за поддържането на редуциращата вътреклетъчна микросреда, която е от съществено значение за нормалната клетъчна функция и жизнеспособност. GSH/GSSG е надежден индикатор за клетъчно-редокс състоянието, а хроничното намаляване на GSH/GSSG отразява намален антиоксидантен капацитет и повишена чувствителност към окислително увреждане. Напоследък увеличаването на оксидативните увреждания на протеини и ДНК се свързва с намаляване на вътреклетъчните и плазмените GSH/GSSG при деца с аутизъм, което предполага, че намалената антиоксидантна защитна способност при тези деца може да има функционални последици по отношение на очевидното окислително увреждане 31

Въпреки че има все повече доказателства, че биомаркери с повишен оксидативен стрес присъстват в кръвта на деца с аутизъм, наличието на оксидативен стрес и дефицит на глутатион в мозъка с аутизъм остава относително подценено. В мозъка на деца с аутизъм Sajdel-Sulkowska et al. 32, 33 установяват значително повишен 3-нитротирозин (3-NT), маркер за увреждане на окислителния протеин и е отбелязана тенденция на повишен 8-оксо-дезоксигуанозин (8-оксо-dG), маркер за окислително увреждане на ДНК. Друга група отбелязва значително увеличение на липидните хидропероксиди в мозъка и преходната кора в случаите на аутизъм в сравнение с контролите. 34 В допълнение, при BA22 са открити по-голям брой клетки, съдържащи липофусцин, матрица от продукти на лизозомно разграждане и маркер на оксидативен стрес в сравнение с контролите. 15 В мозъка с аутизъм прооксидативният глутатион редокс дисбаланс, наблюдаван преди това в плазмата и имунните клетки от деца с аутизъм, също не е изследван.

Като цяло, констатациите от това проучване подкрепят нашата хипотеза и ролята на глутатион редокс дисбаланс и оксидативен стрес в невропатологията на аутизма. Това проучване допълнително предоставя нови доказателства, че производството на митохондриален супероксид може да се увеличи в определени области на мозъка и че невровъзпалителният процес може да стимулира оксидативен стрес и увреждане на засегнатите клетки.

резултатът

Демография на донори на тъкани

Не са открити разлики между аутизма и контролните групи в средната възраст, пол или интервал след смъртта за мозъка или BA22. Расата и причината за смъртта бяха възможно най-близки до наличните случаи и контроли; обаче при няколко индивида расата и причината за смъртта са били неизвестни (допълнителни таблици 1 и 2).

GSH, GSSG, 3-NT, 3-CT и 8-оксо-dG

Фигура 1 показва относителните концентрации на GSH, GSSG, 3-NT, 3-CT и 8-оксо-dG в пробите за аутизъм и контрола и в пробите BA22. Всички измерени метаболити са значително променени при аутизъм в сравнение с идентични контроли в двата анализирани мозъчни региона. GSH е намален в аутистичния мозък с 43% в сравнение с контролния мозък (P

Глутатион редокс дисбаланс и повишени биомаркери на оксидативен стрес в мозъка на аутизма (CB) и Brodmann region 22 (BA22). Бяха използвани високоефективна течна хроматография (HPLC) и HPLC/масспектрометрия за измерване на биомаркери в проби от аутизъм и контролиране на тъкани от CB и BA22 (n = 15 и 12 случая и контроли/група) и нормализирани до съдържание на протеин. Концентрации на редуциран глутатион (GSH; а ), окислен глутатион (GSSG; б ), редокс/антиоксидантен глутатион редуциращ капацитет (GSH/GSSG; ° С ), 3-нитротирозин (3-NT; д ), 3-хлоротирозин (3-CT) д ) 8-оксо-дезоксигуанозин (8-оксо-dG; е ) се отчита като средна стойност ± sd * P ** P = 0,01; # P = 0, 02.

Изображение в пълен размер

Аконитазна активност

Фигура 2а показва активност на аконитаза (nmol min-1 ml -1), измерена както в пробите на мозъка, така и в аутизма и контролите BA22. Средната активност на аконитаза в мозъка от случаи на аутизъм е значително по-ниска, отколкото в мозъчните тъкани от контролите (45,3%; P

Активността на аконитазата е намалена при мозъчен аутизъм (CB) и е свързана с капацитета на глутатион редокс/антиоксидант (GSH/GSSG) в контрола и аутизма CB и регион Brodmann 22 (BA22). ( а ) Аконитазната активност беше измерена в замразени проби след смъртта и контролни тъкани от CB и BA22 (n = 15 и 12 случая и контроли/група) и нормализирана до съдържание на протеин. Данните са представени, тъй като средната активност ± sd аконитаза е значително намалена при аутизъм CB (3, 99 ± 2, 34) в сравнение с контролната CB (7, 29 ± 1, 85). Разликата в активността на аконитазата между аутизъм BA22 (3, 30 ± 1, 88) и контролен BA22 (5, 47 ± 3, 78) не достига значимост. б ) В комбинирания случай и контролната група на CB проби активността на аконитазата е свързана значително с GSH/GSSG (P = 0,01). ( ° С ) При BA22 в комбинирани случаи и контроли, активността на аконитазата е била по подобен начин значително свързана с GSH/GSSG (P = 0,03). Въпреки че значението на корелациите в пробите за аутизъм е без значение, групирането на стойностите на случая (в отворени кръгове) в долния ляв квадрант на всяка графика е очевидно. * Р

8-оксо-дезоксигуанозин (8-оксо-dG) се свързва с редукционно-антиоксидантния капацитет на глутатиона (GSH/GGSG) в мозъка. В комбинирания случай и контролна група от мозъчни проби 8-оксо-dG е значително свързан с GSH/GSSG (P 32, 44) Тези открития се удължават допълнително чрез изследване на по-голяма проба от внимателно подбрани тъкани за множество маркери на оксидативен протеин/Увреждане на ДНК (3-NT, 8-оксо-dG), както и функционални биомаркери на възпалението (3-CT) и производство на митохондриален супероксид (активност на аконитазата).

Относителното намаляване на активността на аконитазата в мозъка на аутизма е важно ново откритие, което предполага функционална последица от оксидативен стрес в тази област. В мозъчната тъкан аконитазата се намира главно в митохондриите, където функционира като ензим в цикъла на трикарбоксилната киселина. Митохондриалната аконитаза е силно чувствителна към окислително инактивиране от супероксидни радикали, които се произвеждат в непосредствена близост от електронната транспортна верига (ETC). Освен че е маркер за увреждане на окислителния протеин, намалената активност на аконитазата се счита за чувствителен показател за повишено производство на митохондриален супероксид. 45, 46

Механизъм на инактивиране на митохондриална аконитаза. Митохондриалната аконитаза е ензим от цикъла на трикарбоксилната киселина (TCA), който катализира превръщането на цитрата в изоцитрат. Той съдържа железо-сярна група ([4Fe-4S]) в активното си място, която се инактивира от супероксид (О -), произведен в непосредствена близост като страничен продукт от електронната транспортна верига. Това води до освобождаването на Fe + 2 и молекула водороден пероксид (H 2 O 2), които могат да реагират чрез реакцията на Фентон, за да образуват хидроксилен радикал (OH). Редукционният капацитет на глутатиона (GSH/GSSG) ще бъде намален поради увеличеното производство на свободни радикали и ще позволи повече инактивация на супероксид аконитаза и ще се създаде цикъл на самоусилване, ако остане нерешен.

Изображение в пълен размер

Инактивация на аконитаза и оксидативен стрес са докладвани при други невропсихиатрични и невродегенеративни разстройства с известни митохондриални разстройства, включително шизофрения, 50, 51 болест на Хънтингтън 52 и болест на Паркинсон. 53, 54 Едно проучване на митохондриалната дисфункция в мозъка на аутизма установи намалени нива на протеини на няколко ETC комплекса в мозъка, фронталната и темпоралната кора. Има доказателства, че митохондриалната дисфункция може да присъства при значителна част от децата с аутизъм и допринася за мултисистемните аномалии, наблюдавани при някои деца с аутизъм. 55, 56, 57 Значително намаляване на активността на аконитазата изисква непрекъснато изследване на взаимодействията между митохондриалната дисфункция, производството на супероксид и променената активност на ETC комплекс при аутизъм.

Окисленото протеиново тирозиново производно, 3-NT, осигурява стабилна биохимична следа от увреждане на окислителния протеин и е установено, че е повишено в плазмата на деца с аутизъм в предишно проучване. 31 Повишени нива на 3-NT са докладвани при много заболявания с патология на оксидативен стрес, включително алкохолизъм, тютюнопушене, диабет, атеросклероза и муковисцидоза. 58 Тирозиновото производно, 3-NT, се състои предимно от пероксинитрит, вреден свободен радикал, генериран от супероксид, и NO. По този начин значителното увеличение на нивата на 3-NT, наблюдавано в мозъка на аутизма и BA22, не е неочаквано и е в съответствие с повишеното производство на супероксид и инактивирането на аконитаза.

Освен че са класически маркер за увреждане на окислителните протеини, повишените нива на 3-NT показват повишено производство на NO. Излишъкът NO се конкурира за антиоксидантите MnSOD и GSH за супероксид и насърчава образуването на пероксинитрит. 59 NO може обратимо да инхибира митохондриалното дишане в комплекс IV, докато по-вредният пероксинитрит може трайно да инактивира комплекси I, III и V. 60 В предишно проучване демонстрирахме повишена чувствителност на подлежащите на аутизация лимфобластоидни клетки към остра мипохондриална деполяризация на NO и други азотни нива, отчетени в плазмата и червените кръвни клетки при деца с аутизъм. 24, 48, 61, 62 Невроглиалните клетки експресират iNOS (индуцируема NO синтаза) и произвеждат големи количества NO, когато се активират от цитокини. 63, 64 Интересното е, че в мозъка на аутизма се съобщава за наличието на провъзпалителни цитокини и активирана невроглия сред други области9, което предполага, че активираната невроглия произвежда излишък на NO и може да допринесе за образуването на пероксинитрити и увеличеното увреждане на 3-NT протеин в момента ... проучване.

Значително повишените нива на 3-CT в мозъка на аутизма и BA22 е ново откритие, предполагащо хронично невровъзпалително състояние в тези области. Активираните фагоцитни клетки произвеждат хипохлорна киселина, продукт на активността на миелопероксидазата (MPO), който се стимулира по време на имунната активация, което води до 3-CT производно. Повишена експресия на MPO е демонстрирана по-рано при хронични неврологични болестни състояния като болестта на Алцхаймер, 65 болестта на Паркинсон 66 и множествената склероза. 67 Наблюдаваното увеличение на 3-CT в проби от мозък на аутизъм и BA22 е първият показател за повишена експресия на MPO в мозъка на аутизма и подкрепя предишни съобщения за микроглиално активиране и възпалителни цитокини в мозъка на аутизма. Ролята на възпалението и микроглиалното активиране в невропатологията на аутизма изисква допълнително проучване и потвърждение.

В допълнение към маркерите за окислително увреждане на протеините, 8-оксо-dG, маркер за окислително увреждане на ДНК, е значително увеличен в мозъка и BA22 от случаите на аутизъм в сравнение с контролите. Адуктът 8-оксо-dG в митохондриалната и ядрената ДНК е премутагенна лезия, образувана предимно от атака на хидроксилни радикали (• OH). Той е свързан с окислително увреждане на ДНК в условия като стареене, рак и прооксидативно излагане на околната среда. 68 В мозъка 8-оксо-dG е отрицателно свързан с GSH/GSSG в комбинираната група от случаи и контролна група (Фигура 3); тази асоциация обаче не достигна значение в региона BA22. Освобождаването на Fe2, свързано с медиирана от супероксид митохондриална инактивация на аконитаза, е доказано, че е важен източник на образуване на OH радикали чрез химия на Fenton. 47 Заедно тези данни показват, че намаленият антиоксидантен капацитет на GSH/GSSG не е достатъчен, за да се предотврати свръхпроизводството на • OH и че незасегнатият • OH може да достигне ядрото и да образува окисляващ ДНК адукт, 8-oxo-dG.

Предсказаните взаимодействия между всеки от измерените биомаркери на оксидативен стрес и увреждане, митохондриална дисфункция и възпаление са показани на Фигура 5. Повишеният супероксид, генериран от дисфункционални митохондрии, насърчава образуването на излишък на H 2 O 2, субстрат за MPO-медииран хипохлорен киселинен синтез. и образуване на възпалителен биомаркер, 3-CT. Повишеният супероксид може да се комбинира с NO, което води до образуването на пероксинитритен радикал и биомаркер за увреждане на окислителните протеини, 3-NT. Хидроксилният радикал се генерира както от инактивирането на аконитаза, така и от активността на MPO и насърчава образуването на 8-оксо-dG. Хроничното увеличаване на тези свободни радикали уврежда редокс/антиоксидантния капацитет на GSH/GSSG, позволявайки неотворено образуване на свободни радикали и самия цикъл на поддържане, което води до хроничен оксидативен стрес и увреждане. Липсата на корелация между възрастта и биомаркерите предполага, че оксидативният стрес е хронично състояние на аутизъм, тъй като същият модел на повишени биомаркери се наблюдава в толкова широк възрастов диапазон.

Предложени взаимодействия между измерени биомаркери и оксидативен стрес. Повишеният супероксид, генериран от дисфункционални митохондрии, насърчава образуването на излишък от H 2 O 2, субстрат за миелопероксидазен (MPO) -медициран синтез на хлорна киселина и образуването на възпалителен биомаркер, 3-хлоротирозин (3-CT). Увеличението на азотен оксид (NO) в комбинация с повишени нива на супероксид води до образуването на пероксинитритен радикал и биомаркер на увреждане от окислителния протеин, 3-нитротирозин (3-NT). Хидроксилният радикал се генерира чрез инактивиране на аконитаза и MPO и подпомага образуването на 8-оксо-дезоксигуанозин (8-оксо-dG). Хроничното увеличаване на тези свободни радикали уврежда глутатион редокс/антиоксидантния капацитет (GSH/GSSG), позволявайки неотворено образуване на свободни радикали и самия цикъл на поддържане, което води до хроничен оксидативен стрес.

Изображение в пълен размер

В обобщение, за първи път показваме, че периферните маркери на оксидативен стрес и увреждания, наблюдавани преди това в плазмата и имунните клетки, са подобно повишени в двете засегнати области на мозъка при аутизъм, малкия мозък и BA22. Тези наблюдения показват, че прооксидативната среда и оксидативният стрес са повсеместни и систематични при лица с аутизъм. Отрицателната връзка между GSH/GSSG и окислителните протеини и увреждане на ДНК предполага, че намаленият редукционен капацитет на глутатион в мозъка с аутизъм може да има функционални последици по отношение на повишеното производство на митохондриален супероксид и хроничен възпалителен статус. Тъй като обаче аутизмът се влияе от много взаимодействащи генетични и екологични фактори, които са специфични за следкланичния мозък и ограниченията на случаите, тези наблюдения ще изискват последващи изследвания.