елементи
абстрактно
За това изследване използвахме нашата установена парадигма PAS (с процедура за обонятелно кондициониране), за да изясним модулаторния ефект на сигнализирането на CB1 рецептора при хедонична обработка на наградата. Тъй като PAS досега е оценяван само при плъхове, друга цел на това проучване е да се определи и потвърди парадигма при лабораторни мишки. Излагането на природни стимули и злоупотреба с наркотици води до свързани с възнаграждението невропластични промени в мозъчните области и наскоро показахме, че острото представяне на вкусен обонятелен стимул при плъхове стимулира непосредствения ранен ген c-Fos в стриаталните области (Friemel et al., 2010). В това проучване ние се опитахме да разширим откритията си, за да проучим участието на други транскрипционни фактори. За да изследваме потенциалните разлики в обработката на невронални награди при WT и KO мишки, ние допълнително изследвахме способността на условната миризма да стимулира стриаталната експресия на FosB/AFosB.
ПРЕДМЕТИ И МЕТОДИ
елементи
За това проучване са използвани общо 132 животни. Мъжки възрастни плъхове Wistar са закупени от Wistar Harlan Laboratories (AN Venray, Холандия). Мъжки възрастни мишки от див тип (WT) и CB1 рецептори (CB1 KO) с генетичен произход C57BL/6J, отглеждани в университета в Бон (Zimmer et al, 1999), бяха транспортирани до Манхайм (Германия). Животните бяха оставени да се възстановят от транспорта и бяха свикнали с новата среда поне 7 дни след пристигането. Всички животни, използвани в настоящите експерименти, бяха съпоставени по възраст (плъхове: 4 месеца; мишки: 2 до 3 месеца). Мишките бяха настанени индивидуално, за да се избегне бръснарско и агресивно поведение в клетките на Makrolon (Eurostandard тип II), а плъховете бяха настанени на групи от четирима (Eurostandard тип IV) в стая за животни в колония от 12 часа светло-тъмно - 1900 часа). Животните получиха безплатен достъп до вода и стандартни лабораторни фуражи през първата седмица след пристигането и бяха поддържани на приблизително 95-97% от телесното си тегло по време на поведенчески тестове, когато беше осигурено висококалорично подсладено кондензирано мляко.
Всички експерименти са извършени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, прието и декларирано от Националния здравен институт и одобрено от местния комитет за хуманно отношение към животните (Карлсруе, Германия).
Експериментален дизайн
В първия експеримент ние изследвахме ефектите на CB1 рецепторния антагонист/обратен агонист SR141716 (SR; Rimonabant) и синтетичния канабиноиден рецепторен агонист WIN 55 212-2 (WIN) върху добре установената PAS процедура при плъхове. Следователно плъховете получават еднократна инжекция от 1 mg/kg SR/превозно средство или 0,3 mg/kg WIN/превозно средство по време на тренировка (SR експеримент: SR n = 16, превозно средство n = 12; WIN експеримент: WIN n = 9, превозно средство n = 12 ). Както е добре известно, че първото инжектиране на канабиноидни агонисти в нелекувани преди това гризачи с лекарства може да се възприеме като отвратително (Schneider and Koch, 2002; Chaperon and Thiebot, 1999), животните в експеримента WIN са получили допълнително еднократна първична инжекция. 0,3 mg/kg WIN, 48 часа преди началото на тренировъчната процедура по PAS. За да се изключи, че хроничното прилагане на SR/WIN може да повлияе на амплитудата на ASR само по себе си, ние допълнително оценихме ASR в друга група животни, които не бяха подложени на обучение за асоцииране с награда. Тези животни също са били тествани два пъти за ASR: веднъж преди и веднъж след хронично приложение на WIN/SR лекарства или подходящ носител (WIN експеримент: WIN n = 6, носител: n = 9; SR експеримент: SR n = 6, носител: n = 7).
Следващите експерименти бяха проведени върху CB1 KO мишки и техните съответни WT котила. Първата кохорта от WT/KO мишки беше използвана за тестване на поведението. Група I беше тествана за прием на подсладено кондензирано мляко (SCM), PAS и за предпочитание на миризмата (WT и CB1 KO: n = 11). Между поведенческите тестове животните са останали необезпокоявани за 3 до 4 дни. Група II е била тренирана фалшиво и е служила като контролна по време на PAS тестване (WT и CB1 KO: n = 7). Втора кохорта от мишки беше използвана за експеримента FosB/AFosB (WT: обучени и подготвени: n = 5; CB1 KO: обучени n = 4, симулирано обучение n = 5).
Бутилка SCM (Nestle AG, Франкфурт, Германия; разредена 1: 3 с чешмяна вода) се използва за всички поведенчески експерименти като награда за хранене. Всички животни бяха свикнали с SCM в домашната им клетка в продължение на 24 часа поне 4 дни преди началото на поведенчески тестове или обучение, за да се избегне невнимание към възнаграждението, предизвикано от новостите.
наркотици
SR (обикновено предоставен NIMH) се разтваря в етанол и Tween-80 и след това се разрежда с физиологичен разтвор (1: 1: 18). WIN (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Германия) се разтваря в 0,1% Tween-80 и се разрежда във физиологичен разтвор (0,9%). И двете лекарства се прилагат интраперитонеално в доза от 1 mg/kg (SR) и 0,3 mg/kg (WIN). SR се инжектира 30 минути и WIN непосредствено преди тренировка с инжекционен обем от 1 ml/kg.
Тестване на поведението
PAS при плъхове
Анализът на PAS се извършва в изненадваща камера (SR-LAB; San Diego Instruments, San Diego, CA), както е описано по-горе (Schneider and Spanagel, 2008; Schneider et al., 2010; Brand et al, 2012). Бял шумов импулс (40 ms, ниво на звуково налягане 100 dB (SPL)) беше използван като импулсен стимул за тестване на уплаха. Времето за аклиматизация от 5 минути, през което плъховете не получават стимул, с изключение на фонов шум (60 dB), беше последвано от представянето на пет първоначални стимула. Следващият тестов протокол се състоеше от 30 стреснати импулса с интерстрален интервал, разпределен произволно между 10 и 20 s. Тестовете за изненада бяха проведени два пъти в присъствието на миризми (портокал, етерични масла; Primavera Life, Sulzberg, Германия), веднъж преди (изходно ASR; ASR1) и отново 48 часа след обучение за асоцииране на миризми (ASR2). Миризмата (30 μl) се осигурява в чашка на Петри, която се поставя в кутия с изненада по време на привикване. PAS се изчислява като средно процентно намаление спрямо изходната амплитуда на ASR (100- (100x средна амплитуда на ASR2/средна амплитуда на ASR1 (базова линия)).
Обучението по възнаграждение продължи 5 дни. По време на всяка ежедневна 90-минутна тренировка, плъховете се поставяха в отделни клетки (Eurostandard тип III) и изпитваха три презентации на миризми в произволни часови точки. Миризмата (оранжева, 15 μl) се добавя към малка чашка на Петри, поставена в центъра на капака на телта, на 2 см под отвора на бутилката за пиене SCM. След безплатен достъп до наградата в продължение на 5 минути, миризмата и бутилката бяха премахнати. Тридесет минути (експеримент SR) или директно (експеримент WIN) преди началото на всяка тренировка, всички животни получиха една инжекция от подходящото лекарство или носител.
PAS в CB1 KO и WT мишки
Тестовете за стряскане при мишки не се различават от протокола, описан по-горе за плъхове, с изключение на интензитета на стряскане (115 dB SPL). Обучението за асоцииране при мишки продължи 5 дни и се различава малко от нашия протокол за плъхове. Обучението се проведе в домашни клетки за мишки. В рамките на всеки ден от 6 часа (от 1000 до 1600 часа) всички мишки изпитваха пет представяния на награда за миризма в произволни точки от време. Миризмата (оранжева, 15 μl) се доставя в малка чашка на Петри, разположена в средата на теления капак, на 2 см под отвора на бутилката. След безплатен достъп до наградата в продължение на 5 минути, миризмата и бутилката бяха премахнати.
За да се потвърди новият PAS протокол при мишки, една допълнителна група беше тествана при симулирани условия. Тези животни преминаха през симулационна процедура за обучение, където им беше даден достъп до SCM в продължение на 5 дни всеки ден в продължение на 25 минути в произволни точки без съпътстващо представяне на миризма. Излагането на миризми се извършва по несвързан начин най-малко 4 часа след/преди подхода на SCM.
Ограничено поемане на SCM при мишки CB1 KO и WT
Животните бяха тествани за прием на SCM в домашната им клетка. В деня на теста се измерва телесно тегло (BW) и животните се поставят обратно в домашната им клетка. Тук им беше предоставен безплатен достъп до бутилката SCM за 30 минути. След това приемът на SCM се изчислява като g прием на kg BW.
Тест за предпочитание на миризмата при мишки CB1 KO и WT
Ролята на предпочитанието на миризмата в открито поле (20 × 20 x 25 cm 3) беше използвана за оценка на способността за откриване на миризма при CB1 KO мишки. По време на тестването в арената бяха поставени две стъклени солнички с еднаква форма (с перфорирани метални капачки), съдържащи филтърна хартия, напоена с 15 μl вода или лимоново масло. Мишките бяха привикнали към арената и (нецентралните) субекти в продължение на 10 минути 24 часа преди тестването. За да се тества за предпочитание на обекта, на мишките беше позволено свободно да изследват ароматите за 6 минути. Животните бяха записани на видео и времето (ите) на изследване на всеки обект бяха анализирани от офлайн експериментатор, заслепен за генотипа на мишката. За да се изчисли процентът на дискриминация на миризмата, времето за изследване на ароматите на лимонена трева беше изразено като процент от общото време на изследване на двата обекта.
имунохистохимия
Стимулиране на FosB/AFosB и подготовка на мозъка
За да се измери експресията на протеин FosB/AFosB, мишките бяха обучени (или подготвени, ако е необходимо) в продължение на 5 дни, за да свържат оранжев аромат с присъствието на SCM, както е описано по-горе за тренировъчния протокол за PAS. Всички животни бяха изложени на оранжева миризма (15 μl) в продължение на 10 минути 48 часа след последното обучение за асоцииране. Животните бяха жертвани 90 минути по-късно чрез обезглавяване и мозъците бяха премахнати, замразени бързо в метилбутан в продължение на 90 секунди и съхранявани при -80 ° С. Замразените мозъци бяха нарязани на 12 mm дебели коронални секции върху криостати и незабавно размразени върху слайдове Superfrost и съхранявани. при -80 ° С. Две мозъчни области, свързани с възнаграждението, nucleus accumbens (NAC) и дорзален стриатум (dStr), бяха избрани като области от интерес.
FosB/AFosB имунохистохимия
Слайдовете бяха размразени и изсушени при стайна температура преди фиксиране в 4% PFA. Слайдовете бяха измити във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и PBS с 0.1% Tween-20 (PBS-T). След 30 минути инкубация с 0,3% H 2 O 2, разтворена в метанол и последващо промиване в PBS/PBS-T, първичното FosB моноклонално антитяло (№ 2251; New England Biolabs GmbH, Франкфурт, Германия), което разпознава както FosB, така и AFosB протеини, се инкубира при концентрация 1: 400 в PBS с 0,2% нормален кози серум за една нощ при 4 ° С. Плъзгачите се промиват отново в PBS/PBS-T и след това се обработват с заешки IgG Vectastain ABC комплект (Vector Laboratories, Burlingame, Калифорния) съгласно инструкциите на производителя. Слайдовете се инкубират с вторично антитяло за 1 час при стайна температура, измиват се и се обработват с авидин и биотин в продължение на 1 час при стайна температура. След това секциите се измиват и имунохистохимично се оцветяват с диаминобензидин (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури) и се прехвърлят в стъпаловидна поредица от разтвори на етанол и ксилол, преди да бъдат покрити в Eukitte (O Kindler GmbH, Freiburg, Германия).
Статистически анализ
Фармакологичните ефекти на WIN и SR върху процента на PAS при обучени и нетренирани плъхове бяха анализирани съответно чрез двупосочен дисперсионен анализ (ANOVA). Ефектите на генотипа (WT/KO) върху поведенческите резултати бяха оценени с помощта на t-тестове на Student, с изключение на времевия ход на ASR и PAS при KO и WT мишки. Тези данни, както и поглъщането на SCM по време на обучението по PAS в експериментите WIN и SR, бяха анализирани чрез повтарящи се мерки ANOVA, използвайки теста на Student-Neuman-Keuls като post hoc анализ. Индуцираната от миризма FosB/AFosB стимулация в NAC и dStr се анализира за всеки генотип с помощта на t-тестове на Student. Според нашите предишни констатации за стимулиране на c-Fos (Friemel et al, 2010), очаквахме да наблюдаваме повишена експресия на FosB/AFosB след тренировка с миризми при WT животни. Поради тази причина, едностранни t-тестове бяха приложени за анализ на данни при WT мишки. Всички данни са изразени като средна стойност ± SEM. Нивото на статистическа значимост е определено като p 
Приятно атенюирано облекчение (PAS), акустичен стряскащ отговор (ASR) и прием на подсладено кондензирано мляко (SCM) при CB1 нокаут (KO) и див тип (WT) мишки. Наблюдавахме стабилен PAS отговор при WT мишки; обаче при CB1 KO мишки се установи, че PAS почти липсва (а). За да се контролират потенциалните вариации в стряскащия навик между тестовите сесии, втора кохорта KO и WT мишки бяха подложени на симулирана процедура за обучение без мирис и тествани съгласно протокола PAS. Не са наблюдавани разлики между генотиповете, което показва подобно повторение на ASR след повторно тестване при животни CB1 KO и WT (b). Лагерът с условна миризма отслабва величината на ASR при WT животни по време на второто стряскане (c), докато такова намаление не се наблюдава при CB1 KO мишки (d). Продължителността на времето в проценти от PAS беше значително по-ниска при CB1 KO мишки по време на тестовата сесия (e). И накрая, свободното поглъщане на SCM беше намалено при CB1 KO мишки в сравнение с контролите на WT (f). Данните са изразени като средна стойност ± SEM (стр
Предпочитание за миризма при мишки с нокаут CB1 (KO) и див тип (WT). И двата генотипа показват сходно предпочитание към ароматния обект по време на тестването на дискриминация на миризми, което показва сравнима способност да възприема миризма при CB1 KO и WT животни. Данните са изразени като средно ± SEM (WT и CB1 KO: n = 11).
Изображение в пълен размер
- Изтеглете слайд на PowerPoint
Индуцирана от миризма FosB/AFosB стимулация при CB1 KO и WT мишки
Примерно оцветяване на FosB/AFosB dStr от контролирани от миризми и контролирани от миризма животни от двата генотипа е показано на Фигура 4. Индукцията на експресията на FosB/AFosB чрез лагер на миризма е значително по-висока при WT мишки, които са преминали обучение за асоцииране с награда. при мишки със симулирано обучение в NAC (t 8 = -1, 99, p = 0,04) (Фигура 5а) и dStr (t8 = -1, 91, p = 0,047) (Фигура 5b). Не се наблюдава обаче такава разлика при CB1 KO мишки (NAC: t7 = 0,88, p = 0,41; dStr: t7 = -0,21, p = 0,84) (фигури 5в и d), което показва, че острата миризма, свързана с острата експозиция на награда, не водят до значително стимулиране на зоните на мозъка, свързани с възнаграждението, при обучени CB1 KO животни.
Стриатални места за вземане на проби и примерно оцветяване с FosB/AFosB. Схемата на короналния мозък илюстрира стабилното положение на гранулите за вземане на проби (500 × 500 μm 2) за гръбния стриатум (dStr) и nucleus accumbens (NAC) в равнината на разреза, съответстваща на +1, 45 до +1, 35 от Брегма. Представителното оцветяване FosB/AFosB dStr от мишки със симулирана миризма и миризма на двата генотипа е показано вдясно.
Изображение в пълен размер
- Изтеглете слайд на PowerPoint
Стимулиране на FosB/AFosB чрез представяне на миризма на апетит при мишки с нокаут CB1 (KO) и див тип (WT). Установено е, че условният етикет на миризма значително увеличава експресията на FosB/AFosB при обучени WT животни в nucleus accumbens (NAC) (a) и гръбната стриатум (dStr) (b) в сравнение с фиктивно третирани контроли. Не може да се наблюдава такава повишена експресия за CB1 KO мишки нито в NAC (c), нито в dStr (d). Данните са изразени като средна стойност ± SEM (стр