вродена

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • Предмети и методи
  • елементи
  • Абсолютно отлично секвениране
  • Контролирана мутагенеза на пълния Filamin C
  • Клетъчна култура и имунофлуоресценция
  • Western blot анализ и последователно извличане на протеини с детергент
  • имунохистохимия
  • резултатът
  • дискусия

елементи

  • Генетични изследвания
  • Последователност от ново поколение

абстрактно

При по-голямата част от педиатричните пациенти с разширена кардиомиопатия специфичната етиология е неизвестна. Изследвания със семейства с разширена кардиомиопатия илюстрират ролята на генетичните фактори в кардиомиопатичната етиология. В това проучване приложихме абсолютно отлично секвениране на членове на разединено семейство, засегнато от неотчетен по-рано синдром на вродена дилатативна кардиомиопатия, който изисква ранна сърдечна трансплантация. Екзомомен анализ идентифицира хетерозиготни варианти на съединението в гена FLNC. Хистологичният анализ на сърдечния мускул показва значителни саркомерни и миофибриларни аномалии, а имунохистохимичното оцветяване показва наличието на агрегати на Filamin C в сърдечните миоцити. Ние заключаваме, че биалелните варианти на FLNC могат да причинят вродена дилатативна кардиомиопатия. Тъй като свързаните клинични признаци на засегнатите пациенти са леки и могат лесно да бъдат пренебрегнати, FLNC тестване трябва да се обмисли при деца с разширена кардиомиопатия. .

Предмети и методи

елементи

а ) Семейно родословие, демонстриращо възрастта на индивидите и сегрегация на мутантни алели FLNC. Алелът от див тип FLNC е маркиран със знак плюс. Попълнените символи означават засегнатите лица. Диагонални линии чрез символи означават починалия. б ) Еволюционно съхранение на домейна FLNC, който съдържа F106L missense вариант (червен), при различни гръбначни животни (сравнение и защита на гръбначни животни, сравнение и защита на условия, UCSC браузър на генома). ° С ) Електроферограми, показващи FLNC мутации при пациента и неговите родители. Пълноцветната версия на това изображение е достъпна в European Journal of Human Genetics онлайн.

Изображение в пълен размер

Абсолютно отлично секвениране

Екстракцията на геномна ДНК, обогатяването на екзома, секвенирането и анализът бяха завършени, както е описано по-горе. 3 варианта бяха филтрирани, за да се създаде окончателен списък само с редки функционални варианти (миссенс, глупости, варианти на сайтове за сплайсинг и indels). Премахнати са варианти с по-ниска честота на алела> 0,01 в сървъра Exome Variant (издание ESP6500) или такива с брой алели> 150 в базата данни на европейските проби на ExAC (NFE). Анализите за валидиране и сегрегация бяха извършени, както е описано. 3 варианта бяха оценени спрямо референтни последователности, съхранявани в Националния център за биотехнологична информация (FLNC: NM_001458.4). Вариантни данни бяха предоставени на ClinVar (SUB1474516; //www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/).

Контролирана мутагенеза на пълния Filamin C

СДНК клон с пълна дължина за FLNC (NM_001458.4) с N-терминал Myc-DDK-Tag е получен от OriGene (Rockville, MD, USA). Направена мутагенеза, насочена към сайта, за генериране на клонинги с варианти p.F106L, p.R991 *, като се използва QuikChange II XL насочен към сайта мутагенезен комплект съгласно препоръките на производителя (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) и специфични олигонуклеотиди (за c.318C> G, стр. (F106L), напред - 5'-GCCCTCGAGTTgCTCGAGCGCGA-3 'и обратен - 5'-TCGCGCTCGAGcAACTCGAGGGGC-3'; за c.2971C> T, стр. (R991 *), напред - 5 ' -CTGGGGGGA 3 'и назад - 5'-GCCAGCCCCTCaTGTGTTCACAG-3'; за F106L-s, 5'-ATGAGCACCAAGTGCG-3 '; Въвеждането на правилния вариант и отсъствието на други варианти беше потвърдено чрез секвениране на Sanger.

Клетъчна култура и имунофлуоресценция

Western blot анализ и последователно извличане на протеини с детергент

Клетките се нуклеофектират с 2 μg от всеки плазмид и се анализират в присъствието на протеин 48 часа след трансфекцията. За екстракция на протеин, култивираните клетки се промиват два пъти с 1 x PBS и се лизират в RIPA буфер (100 mM Tris-HCl (рН 8,0), 150 mM NaCl, 10 m EDTA, 1% натриев дезоксихолат, 1% Triton X -100, 0, 1% SDS), допълнен с пълен коктейл с инхибитор на протеаза без EDTA и PhosStop EASYpack (Roche). Клетъчните лизати се центрофугират при 13 000 g в продължение на 5 минути и супернатантата се запазва. Концентрацията на протеин беше оценена чрез техниката на бицинхонинова киселина (Pierce BCA Protein Assay Kit, Waltham, MA, USA). Протеините се пускат върху 8% SDS-PAGE гелове, прехвърлят се в нитроцелулозни мембрани, блокират се с 5% обезмаслено мляко на прах в TBS-T буфер (20 mM Tris (pH 7, 4), 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) и инкубирано през нощта при 4 ° С със следните първични антитела: анти-DDK етикет антитяло (Cell Signaling, Beverly, МА, САЩ) и анти-актин (Sigma, St. Louis, MO, USA). Първичните антитела бяха открити с конюгирани с хрян пероксидаза, специфични за вида вторични антитела (Jackson Immunoresearch (West Grove, PA, USA) или Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)) със субстрат Luminata Forte Western HRP (Millipore, Billerica, MA, USA ). ) с помощта на LAS-300 FUJIFILM (Токио, Япония).

имунохистохимия

резултатът

Сравнително проучване на геномна хибридизация не показва промени в броя на копията. Освен това, цялото секвениране на екзома беше извършено на пробанда, неговата 16-годишна медицинска сестра и техните родители. Секвенирането беше извършено с помощта на Illumina HiSeq 2500 (Сан Диего, Калифорния, САЩ), за да се генерират сдвоени резултати от 150 bp при средно покритие 95 ×. Точните резултати бяха анализирани за всички режими на наследяване и разкриха хетерозиготно съединение от миссенс и варианти със спиране на печалбата в гена FLNC: g. [128471009C> G]; [128484099C> T]. Първият миссен вариант, c. [318C> G], стр. (F106L), според базата данни на ExAC (//exac.broadinstitute.org), е намерен четири пъти при 32 261 европейци и е наследен от майка си. Фенилаланинът в тази позиция е силно запазен в еволюцията (Фигура 1b) (GERP + = 4, 5, phyloP100way = 3, 2, 5, 6) и се очаква да пречи на всички изследвани прогнозирани алгоритми (SIFT, Polyfen2, LRT, VariantTaster, VariantAssessor, FATHMM). Вторият вариант, c. [2971C> T], стр. (R991 *), е вариант със стоп печалба/глупост, който все още не е вписан в никоя база данни и е прехвърлен от бащата. Установено е, че вариантите във FLNC се разделят, както се очаква в семейството. Анализ на проба от починала ДНК на брат или сестра разкри същата хетерозиготност на съединението за FLNC варианти (Фигури 1а и в).

Тъй като хетерозиготните варианти на FLNC са свързани с миофибриларни и дистални миопатии, 7, 8, 9, 10, 11, е извършена неврологична оценка при всички членове на семейството, за които е установено, че са носители на варианти (седем субекта; на възраст 5–72). Години). Неврологичните прегледи и ехокардиограмите бяха нормални за всички субекти.

Изображение в пълен размер

дискусия

И накрая, препоръчваме да се обмисли тестването на Filamin C. при деца с дилатативна кардиомиопатия. Ранната молекулярна диагностика е важна за прогнозиране, лечение и профилактика на бързо прогресираща сърдечна недостатъчност и животозастрашаващи аритмии.