• абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Соевият пептид потиска индуцираната от DMBA туморогенеза на гърдата
  • Соевият пептид потиска експресията на HSP90 и NF-κB протеини in vivo
  • Индуцирана от соев пептид апоптоза в човешки ракови клетки на гърдата
  • дискусия
  • методи
  • звяр
  • Диетична подготовка и приготвяне на соев пептид
  • Модел на туморогенеза на гърдата
  • Анализ на микрочипове
  • Имуноблот анализ и колориметричен анализ на активността на каспаза-3
  • имунохистохимия
  • Клетъчна култура и MTT анализ
  • Тестове за апоптоза
  • Статистически анализ
  • Терминологичен речник

абстрактно

По време на канцерогенезата, NF-κB медиира процеси, свързани с дерегулация на нормален контрол на пролиферацията, ангиогенезата и метастазите. По този начин, потискането на NF-кВ е свързано с химиопрофилактика на рака. Колективните открития показват, че протеинът на топлинен шок 90 (HSP90) е молекулярен шаперон и е част от комплекса IκB киназа (IKK), който играе централна роля в активирането на NF-κB. HSP90 също стабилизира ключови протеини, участващи в контрола на клетъчния цикъл и сигнализирането за апоптоза. Изследвахме дали екзогенното приложение на изофлавон-изчерпан соев пептид предотвратява 7,12-диметилбенз [а] антрацен (DMBA) -индуцирана туморогенеза при плъхове и изследва механизма на действие. Диетичното приложение на соев пептид (3,3 g/плъх/ден) значително намалява честотата на дуктални карциноми (50%), броя на туморите на множество плъхове, носещи тумор (49%; P

потиска

Експериментален дизайн на индуцирана от DMBA туморогенеза на млечна жлеза на плъхове. Три групи от 4-седмични женски плъхове Sprague Dawley са били хранени с контролна диета или соева пептидна диета в продължение на 4 седмици преди приложението на DMBA. Всяка диета продължи от 9-та седмица до края на експеримента. Всяка група се състоеше от 12 плъха. Контролна диета + прием на сусамово масло; Контролна диета + администриране на DMBA; Соева пептидна диета + DMBA приложение.

Изображение в пълен размер

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

Соевият пептид потиска експресията на NF-κB и HSP90 протеини in vivo. (А) Представително имунохистохимично оцветяване на туморната тъкан на гърдата от контролна диета + DMBA и соев пептид + DMBA група. Имунохистохимичното оцветяване за HSP90 и NF-kB протеини (p65) показва силно положително оцветяване в дуктален карцином от контролна диета + DMBA група (ляв панел), докато много слабо оцветяване на всеки протеин в соев пептид + DMBA група (десен панел), Оригинално увеличение, 400 ×. (Б) Ефект на соевия пептид върху свързаната с апоптоза експресия на протеин. Екстракт от цяла тъкан, приготвен от гръдна тъкан, получен от животни от всяка група, се анализира чрез Western blot анализ с посоченото антитяло, както е описано в процедурите. За контрол на натоварването се използва control-актин. (C) Соев пептид + DMBA група увеличава активността на каспаза-3. Активността на каспаза-3 се изследва, като се използва DEVD субстрат с цели тъканни лизати, приготвени от контролна диета + DMBA тумори или соев пептид + DMBA.

Изображение в пълен размер

Индуцирана от соев пептид апоптоза в човешки ракови клетки на гърдата

За да се изследва дали соевият пептид потиска растежа на човешки ракови клетки на гърдата, MCF-7 клетките се инкубират в продължение на 72 часа в присъствието на различни концентрации на соев пептид и растежът на клетките се оценява чрез MTT анализ. Соевият пептид инхибира растежа на MCF-7 клетките в зависимост от дозата, с почти 50% потискане на клетъчната жизнеспособност при концентрация от 500 μM (Фигура 4А). Обработката на соев пептид при 1 mM в продължение на 24 часа предизвиква значителна ядрена фрагментация, както е видно от DAPI ядрено оцветяване, както и клетъчни морфологични промени (Фигура 4В). Индукцията на апоптоза се потвърждава допълнително чрез двойно оцветяване на анексин V-PI (Фигура 4С). Наблюдавахме> 7-кратно нарастване на апоптозата в третирани със соев пептид клетки.

Потискането на NF-kB и HSP90 от соев пептид индуцира апоптоза на MCF-7 клетки на човешка гърда. (А) MCF-7 клетки се поставят в 96-ямкова плака при 5 х 10 3 клетки и се инкубират при 37 ° С. След инкубация през нощта клетките се отглеждат в прясна контролна среда или в прясна среда, съдържаща посочената концентрация на соя пептид за 72 часа. Клетъчният растеж се определя от средната абсорбция. Всеки експеримент се извършва в три екземпляра. (Б) Соевият пептид предизвиква ядрена фрагментация. MCF-7 клетките, поставени на 4-камерно стъкло, се третират с 1 mM соев пептид в продължение на 24 часа и след това се фиксират в етанол, последвано от DAPI оцветяване. Клетъчната морфология се наблюдава чрез светлинна микроскопия и ядрата се изследват чрез флуоресцентна микроскопия. (C) Индукция на апоптотична клетъчна смърт от соев пептид. MCF-7 клетки, третирани със среден или 1 тМ соев пептид в продължение на 24 часа, се инкубират с маркиран с FITC анексин V и PI и след това се анализират чрез FACS. (D) Резюме за потискане на туморогенезата на гърдата чрез соев пептид без изофлавон.

Изображение в пълен размер

дискусия

За по-нататъшно изследване на механизма на хемопревентивния и туморно супресиращ ефект на соевия пептид, ние търсихме неговите целеви молекули и открихме HSP90 като един от по-регулираните гени. В допълнение, нашият cDNA микрочип разкри драматично потискане на циклин-зависимата киназа 4 (cdk4) и VEGF иРНК в тъкани на плъхове, хранени със соева пептидна диета (Таблица 3). Като цяло соевият пептид може да упражнява химиопрофилактичен и туморен супресиращ ефект чрез инхибиране на NF-κB-медиирано сигнализиране.

HSP90 е молекулярен шаперон, необходим за стабилността и функцията на много сигнални протеини, участващи в насърчаването на растежа или оцеляването на раковите клетки, или и двете. Важни протеини, като Akt, Raf, Cdk4, Her2 и HIF-1α, са идентифицирани като клиенти на HSP, често участващи в припокриващи се пътища за оцеляване на раковите клетки (Maloney and Workman, 2002; Neckers and Ivy 2003; Takayama et al., И др.)., 2003). Членовете на HSP90 също са необходими за индуцируемата и конститутивна активност на комплекса IKK и NF-kB (Broemer et al., 2004). Нашият анализ на cDNA микрочипове също така предполага потенциалното участие на соевия пептид в други важни процеси, като инвазия на тумори и ангиогенеза, контрол на ключовата генна експресия и активност. Заедно соевият пептид може да инхибира много важни биологични процеси, участващи в апоптозата, прогресията на клетъчния цикъл, ангиогенезата и туморната инвазия, което води до неговия химиопрофилактичен и потискащ ефект върху туморогенезата на гърдата in vivo. .

Накратко, една от основните констатации на това проучване е, че лишеният от изофлавон соев пептид може да упражнява своите химиопрофилактични и супресивни ефекти върху тумора чрез инхибиране на NF-κB сигналния път, включен в много аспекти на туморогенезата. Потискането на основния ангиогенен фактор VEGF от соев пептид също предполага неговия потенциален антиангиогенен ефект, медииран от NF-кВ супресия при туморогенеза на гърдата. Проучванията, изследващи ефектите на соевия пептид върху други процеси, участващи в ангиогенезата и метастазите, както и лекарствената резистентност, ще предоставят по-нататъшна представа за механизма на изчерпания с изофлавон соев пептид при профилактиката и/или потискането на рака на гърдата заедно с минимални странични ефекти .

методи

Женски плъхове Sprague-Dawley са закупени от Daehan Biolink Co., LTD (Chungbuk, Корея). На 3-седмична възраст плъховете са хранени с AIN-76 диета за растеж (Американски институт по хранене 76) в продължение на 1 седмица. Животните бяха настанени в стая, поддържана с постоянна температура (22 ± 2 ° C) и влажност (55 ± 5%) под 12 часа светлина и 12 часа тъмнина на ден. На 4-седмична възраст плъховете бяха разпределени в една от трите групи: 1) контролна диета + група сусамово масло (n = 12) получи контролна диета и служи като отрицателна контрола; 2) контролна диета + DMBA група (n = 12) е определена като положителна контрола и е получена контролна диета; и 3) соевият пептид + DMBA група (n = 12) получи експериментална диета, съдържаща соев пептид (виж по-долу). Диетите бяха осигурени под формата на прах, а водата от чешмата беше осигурена при необходимост и за трите групи.

Диетична подготовка и приготвяне на соев пептид

Диетата AIN-76 е модифицирана диета на Американския институт по хранене 76, състояща се от 18% протеин, 10% мазнини, 15% царевично нишесте, 5% целулоза, 3,5% минерална смес AIN-76, 1% витамин AIN смес, 0,2 % холин битартрат и 47,3% захароза. Контролната диета осигурява казеинов протеин и е изокалорична и изопротеин. Осигурена е и соевата пептидна диета

Модел на туморогенеза на гърдата

Анализ на микрочипове

Общата РНК от изрязани тумори на гърдата се изолира, като се използва екстрагент TRIzol (Gibco BRL, Rockville, MD), съгласно препоръките на производителя. Целостта на MRNA се потвърждава чрез денатуриране на 1% електрофореза в агарозен гел. Микрочипът cDNA на плъх съдържа 5K cDNA клонинги, избрани от индекса на плъховите гени на GenomicTree Inc. (Daejun, Корея).

Имуноблот анализ и колориметричен анализ на активността на каспаза-3

Нормални млечни жлези на плъхове и тумори на гърдата (по 100 mg) се хомогенизират в 800 μl ледено студен хомогенизационен буфер (20 mM HEPES [рН 7.4), 75 mM NaCl, 2.5 mM MgCl 2, 0.2 mM EDTA, 0.2 05% Triton X -100, 20 mM β-глицерофосфат, 1 mM Na 3 VO 4, 0,5 mM DTT, 10 mM NaF и коктейл инхибитор на протеаза (Roche, Mannheim, Германия), както е описано по-горе (Lee et al., 2002) Лизати на тъкани (50 μg ) бяха разделени чрез SDS-PAGE и имуноблотирани с посочените първични антитела срещу NF-кВ (р65, 1: 500), HSP90 (1: 1000), р53 (1: 1000), р21. (1: 500) и каспаза- 3 (1: 1,000), последвано от инкубация с подходящи HRP-конюгирани вторични антитела в продължение на 1 час и след това се открива с ECL реагент (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL), както е описано по-горе (Park et al., 2005) същото количество протеини се потвърждава чрез инкубация с анти-β-актинови антитела.За да се определи активността на каспаза-3, 40 μg от всеки тъканен лизат се инкубира с колориметър i c DEVD субстрат (Calbiochem) при 30 ° C в продължение на 3 часа и след това абсорбцията при 405 nm (OD 405) се измерва с помощта на Xfluor 4 спектрометричен четец (TECAN, Австрия).

имунохистохимия

Оцветяването с имунопероксидаза се извършва съгласно протоколите, предоставени от производителя (комплект Dako LSAB; Dako, Carpinteria, СА), както е описано по-рано (Nam et al., 2001). Накратко, участъци с дебелина 5 μm, монтирани върху предметни стъкла, бяха третирани с посочените първични антитела (anti-NF-κB [p65], 1: 500; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) или анти-HSP90 антитяло (1).: 1000; Stressgen Biotechnologies, Виктория, Канада), последвано от инкубация с биотинилирани вторични антитела. Свързаната пероксидаза се визуализира чрез добавяне на субстрат-DAB разтвор и предметите се оцветяват с хематоксилин на Mayer (DAKO), за да оцветят ядрата. Положително оцветените клетки изглеждаха кафяви, докато отрицателните клетки изглеждаха сини.

Клетъчна култура и MTT анализ

MCF-7 клетки, получени от аденокарцином на човешка гърда, са получени от American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Клетките се отглеждат в RPMI 1640, допълнена с 10% FBS и 1% пеницилин и стрептомицин в атмосфера от 5% CO 2 при 37 ° С. МТТ колориметричният анализ се извършва, както е описано по-горе (Park et al., 2001). Инхибирането на растежа се измерва чрез средна абсорбция с помощта на четец за плочи (Termomax, Molecular Device) при 540 nm. Всеки експеримент се извършва в три екземпляра.

Тестове за апоптоза

Апоптоза-медиираната клетъчна смърт е изследвана, както е описано (Lee et al., 2008) с малки модификации. Накратко, MCF-7 клетки се посяват върху предметни стъкла с плътност 5 х 104 клетки на гнездо и след това се обработват с 1 mM соев пептид, разтворен в среда RPMI 1640 в продължение на 24 часа. Клетките се инкубират с маркиран с анексин V и флуоресцеин изотиоцианат (FITC) пропидиев йодид (PI) в продължение на 15 минути и след това се анализират на FACS Vantage (Becton Dickinson, San Jose, CA). За да се оцени ядрената морфология, клетките се поставят върху предметно стъкло, фиксират се в метанол и се оцветяват с DAPI (1 μg/ml в метанол) в продължение на 15 минути, промиват се три пъти с 1 x PBS и след това се третират с VectaShield (Vector Laboratories) ( И изследван под флуоресцентен микроскоп.

Статистически анализ

Бяха определени телесно тегло и прием на храна и статистическата значимост на разликите в данните беше оценена чрез еднопосочен ANOVA. Теглото на тумора, латентността, обемът на тумора и множествеността на тумора се изчисляват чрез независим t-тест във всяка точка от времето. Стойността на вероятността COX-2 се счита за статистически значима