клетка

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Циркадна регулация на системата грелин-GOAT при мишки
  • Циркадна регулация на системата грелин-ГОАТ в клетъчна линия на миши грелином
  • дискусия
  • методи
  • звяр
  • Експериментален дизайн: циркадна регулация на грелин при WT и Bmal1-KO мишки
  • Експерименти с клетъчна култура, серумен шок и стимулиране
  • Експерименти с ниска РНК интерференция
  • АРИ на Грелин
  • Количествена PCR в реално време
  • имунохистохимия
  • Статистически анализ
  • Повече информация
  • Коментари

елементи

абстрактно

Грелин, 28-аминокиселинен чревен пептид, е идентифициран през 1999 г. като ендогенен лиганд на рецептора на секретагога на растежен хормон тип 1А. Съобщава се, че пост-транслационното октаноилиране на грелин до серин-3, катализирано от ензима грелин-О-ацилтрансфераза (GOAT), е от съществено значение за неговата биологична активност 2, 3. Независимо от това, октаноил грелинът представлява само около 10% от целия циркулиращ грелин, докато останалите 90% са неацилирани 4. През годините след откриването му е доказано, че грелинът не само медиира освобождаването на растежен хормон, но и контролира други основни физиологични функции. Грелинът увеличава приема на храна, като стимулира освобождаването на орексигенови невропептиди, свързан с агюти пептид (AgRP) и невропептид Y (NPY) от ядрото на хипоталамусната арка 5 и поради това се счита за физиологичен инициатор на храна. Освен това има стимулиращи ефекти върху затлъстяването и стомашната подвижност и е важен медиатор на глюкозната хомеостаза 6, 7. Други физиологични функции на грелина включват модулация на клетъчната пролиферация, имунната система, хрущялната и костната хомеостаза, съня, паметта и поведенческите ефекти.

Поради комбинираното действие на няколко медиатори, плазмените нива на грелин се колебаят непрекъснато през целия ден. Хранителният статус е първият и добре документиран регулатор на освобождаването на ендогенния грелин. При гризачите нивата на циркулиращ грелин се увеличават чрез глад 8, 9 и се потискат чрез многократно дозиране 9. По същия начин нивата на грелин в плазмата се увеличават при здрави доброволци приблизително един час преди редовно хранене и след това рязко падат 10. Индуцираното на гладно повишаване на нивата на грелин в плазмата зависи от холинергичните и адренергичните рамена на автономната нервна система 11, 12, 13, докато потискането на нивата на грелин след хранене се медиира от калоричното съдържание и вида на хранителните вещества 14, 15, макар и не напълно Счита се, че чувствителността на хранителните вещества е медиирана предимно чрез активиране на различни вкусови рецептори, присъстващи в ентероендокринните клетки, включително стомашни грелини 16, 17, 18, 19 .

Целта на това проучване е да се изследва значението на генната функция за часовниците в циркадния ритъм на експресия и секреция на грелин. Първо изследвахме ефекта от генетичната делеция на гена за ядрен часовник Bmal1 върху 24-часовите колебания в нивата на плазмата и стомашния грелин и експресията на GOAT при мишки. Второ, ние изследвахме възможността клетките, секретиращи грелин, да могат да действат като FEO, като изучаваме ефектите от гладуването или храненето като реплика като тригери на циркадна ритмичност в клетъчната линия на грелинома.

резултатът

Циркадна регулация на системата грелин-GOAT при мишки

WT мишките проявяват типично нощно поведение и консумират по-голямата част от храната си по време на тъмния цикъл (Фиг. 1а). Приемът на храна започна да се увеличава от Zeitgeber (ZT) 8 пъти и достигна най-високите нива, които определят ритмичната акрофаза, на ZT 21. Тъй като приемът на храна се стимулира от освобождаването на свързания с ажути орексигенен пептид (AgRP) от ядрото на дъгата, ние определя нивата на експресия на иРНК на иРНК на хипоталамуса на този невропептид. Акрофаза (ZT 21) на циркадния ритъм на експресия на AgRP иРНК (период 23 часа, P

( а ) Прием на храна, ( б ) хипоталамусни относителни нива на експресия на mRNA AgRP, ( ° С ) плазмени нива на октаноил грелин и ( д ) общите плазмени нива на грелин в WT или Bmal1-KO мишки ad libitum. ( д, е ) Относителни нива на експресия на грелин ( д ) и КОЗА ( е ) тРНК в стомаха на WT или Bmal1-KO мишки (п = 7-8 мишки/времева точка/генотип). Светлата и тъмната фази са засенчени от бяло и сиво. (AU = всяка единица).

Изображение в пълен размер

При WT мишки плазмените нива на октаноил грелин се колебаят циркадно (период 23 часа; P

( а - е ) Представителни секции на корпусни секции, оцветени за октаноил грелин при WT мишки ( а - в ) или Bmal1-KO ( г - е ) в ZT 8 ( a, d ), ZT 12 ( бъда ) и ZT 20 ( c, f ). ж ) Снимка на секцията за отрицателен контрол без първични антитела. ( з ) Брой клетки, имунореактивни за октаноил грелин/mm2 и ( i ) интензивност на оцветяването с октаноил грелин в корпусните части на WT или Bmal1-KO мишки (n = 3 мишки/времева точка/генотип). Светлата и тъмната фази са засенчени от бяло и сиво. (AU = всяка единица).

Изображение в пълен размер

Циркадни колебания в нивата на експресия на грелин в стомашна иРНК са наблюдавани и при WT мишки (20-часов период, Р 29 индуцирани силни трептения в транскрипционно натрупване на иРНК на всички гени за часовници с изключение на часовници (Фиг. 3).

Относителни нива на експресия на иРНК ( а ) Bmal1, ( б ) Часовник, ( ° С ) Cry1 и Cry2, ( д ) Per1 и Per2, ( д ) Per3 a ( е ) Rev-erb-α в MGN3-1 клетки от грелином в отговор на синхронизация на серумен шок. (AU = всяка единица).

Изображение в пълен размер

Освен това изследвахме дали секрецията на грелин следва циркаден ритъм в отговор на стимулация от съединения, които медиират освобождаването на грелин или на празен стомах (L-епинефрин), или в състояние на насищане (пептон, смес от аминокиселини и пептиди). За тази цел серумните шокови клетки се инкубират с тези съединения на всеки 4 часа в продължение на 3 часа. Базалната секреция на октаноил грелин (лечение с носител) не показва циркаден ритъм за разлика от общата секреция на грелин (период от 26 часа, P

В това проучване ние сме първите, които демонстрираме, че генетичната делеция на ядрото Bmal1 на ядрото на часовника не само елиминира циркадния ритъм на сигнализиране на грелин и по този начин циркадния ритъм на прием на храна, но също така намалява абсолютното производство на грелин и GOAT иРНК. Освен това предоставяме убедителни доказателства, че при липса на основен часовник, свързаните с храната сигнали могат да привличат молекулярен часовник в стомашно-секретиращата грелин клетка и да регулират ритмичната секреция на грелин. В допълнение, диференциалните реакции в освобождаването на октаноил и общия грелин в пептона с храната, заедно с ритмичната експресия на GOAT, но не и mRNA на грелин в клетките на грелином, предполагат, че клетката на грелин като FEO не само регулира циркадния грелинов ритъм, но може би дори повече важно от GOAT.

Нашето проучване in vivo върху WT мишки потвърждава предишни наблюдения, че плазмените нива на грелин се колебаят циркадно и достигат максимални нива по време на неактивната фаза на тялото 20, 21, 22, 23. Увеличението на натрупването на грелин и GOAT иРНК в ZT4 предполага, че циркадната система е предсказала освобождаването на грелин в ZT 8, вероятно причинявайки ритмичност от тези гени чрез елементи на E-box в техните промоторни области 31. Броят на имунореактивните клетки остава постоянен в продължение на 24 часа, което предполага, че обикновено всички клетки на стомашния грелин също допринасят за секрецията на този пептид. Освен това интензивността на оцветяването на грелин се наблюдава в антифаза с плазмените нива на грелин, което подчертава, че стомахът служи като основен източник на циркулиращ грелин 32, 33, 34 .

Въпреки тенденцията си да увеличават приема на калории, мишките Bmal1-KO показват значително по-ниско телесно тегло в сравнение с контролите на WT. Няколко проучвания подчертават, че заличаването на гени с циркаден часовник при мишки може драстично да промени телесното тегло и телесния състав 37, 38, 39, 40. Съобщава се, че Bmal1 играе решаваща роля в контрола на адипогенезата и липидния метаболизъм 41, 42. Намаленият капацитет за съхранение на мазнини при мишки Bmal1-KO може да обясни защо увеличаването на приема на храна не е придружено от увеличаване на телесното тегло.

Интересното е, че за разлика от нашето проучване in vivo, експресията на грелин иРНК в клетки MGN3-1 трептя по циркаден начин, което предполага, че е необходим външен вход за ритъма, наблюдаван при нивата на грелин иРНК in vivo. За разлика от грелина, експресията на GOAT иРНК в култивирани клетки показва циркаден модел, което предполага, че ритъмът на този ензим се регулира независимо от основните часовници.

Тълкуването на резултатите се усложнява от наблюдението, че моделът на обща секреция на грелин в отговор на използваните стимули не винаги съответства на модела на октаноил грелин. Докато буферът на HEPES не предизвиква ритъм в секрецията на октаноил грелин, той има обща секреция на грелин. За разлика от това, при пептона се наблюдава обратното, като ритмичността се открива в октаноила, но не и в общата секреция на грелин. В допълнение, L-адреналинът успява да предизвика ритмичност и при двете форми на грелин. Тези разлики не бяха придружени от промени в моделите на експресия на иРНК на грелин или GOAT. Не можем обаче да изключим, че тези симптоми на хранене или на гладно са предизвикали промени в нивата на протеини или са повлияли на ензимната активност на GOAT. Бъдещите проучвания следва допълнително да изследват дали циркадният контрол на сигнализирането на грелин може наистина да бъде медииран от разликите във времето в активността или нивата на протеин на този уникален октаноилиращ ензим.

Взети заедно, тези резултати предполагат, че молекулните часовници в секретиращите грелин стомашни клетки регулират не само грелина, но и активността на GOAT в отговор на различни стимули, свързани с храната. Освен това те предполагат, че регулирането на секрецията на грелин е дори по-сложно, отколкото се е смятало първоначално, както на гладно, така и след хранене. Необходими са допълнителни проучвания за допълнително идентифициране на основните механизми.

Трансфекцията на клетки от грелином със специфична за Bmal1 siRNA не променя секреторния отговор на клетките, секретиращи грелин, към пептон или L-епинефрин. Като се има предвид, че и двата стимула успяха да индуцират циркаден модел в секреторния отговор на клетките MGN3-1 и че мишките Bmal1-KO липсваха циркадни ритми в освобождаването на грелин, това беше по-скоро контраинтуитивно откритие. Въпреки това, медиираният от siRNA нокдаун на Bmal1 може да бъде потиснат от серумен шок. Високите серумни концентрации, необходими за синхронизиране на клетъчния циркаден часовник, могат да стимулират клетъчния растеж и делене, като по този начин пречат на процеса на нокдаун. От друга страна, неотдавнашни проучвания показват, че тактовата мрежа използва активни механизми за компенсация, а не просто излишък, за да функционира като генетична балансираща система, за да поддържа функцията на часовника, когато е изправена пред генетични и екологични нарушения 52, 53 Следователно нокдаунът Bmal1 може да бъде повлиян от други компоненти на циркадната система, осигурявайки съпротивлението на молекулярния часовник.

В заключение, това проучване подчертава значението на гена за ядрен часовник Bmal1 в циркадния ритъм на грелин и по този начин в циркадния ритъм на прием на храна. Констатацията, че стомашната грелин-секретираща клетка проявява ендогенен циркаден секреторен отговор на свързани с храната сигнали, подчертава значението на времето за консумация на храна при определяне на отделянето на грелин. Освен това, тъй като циркадната система също така контролира сигнализирането на грелин чрез октаноилиращия ензим GOAT, тези резултати подчертават необходимостта от допълнително характеризиране на ролята на този уникален ензим и развитието на фармакологични модулатори на активността на GOAT.

методи

Размножаващи се двойки мишки, хетерозиготни за Bmal1, бяха любезно предоставени от R. Lijnen (KU Leuven, Leuven, Белгия). Всички KO мишки и техните котила WT бяха настанени в животновъдно съоръжение в Leuven KU и генотипизирани чрез PCR анализ, извършен върху обща геномна ДНК на опашката. Мишките бяха настанени в контролирана от температурата среда (20-22 ° C) при 12 h/12 h h цикъл светлина/тъмнина (където ZT 0 е конвенционалният превключвател на светлината) и имаха свободен достъп до храна и питейна вода. Всички експерименти бяха одобрени от Етичния комитет за опити с животни в KU Льовен и проведени в съответствие с одобрените насоки.

Експериментален дизайн: циркадна регулация на грелин при WT и Bmal1-KO мишки

WT и Bmal1-KO мишки (50% мъжки и 50% женски) на възраст от 12 до 16 седмици бяха умъртвени за 24 часа на интервали от 4 часа. Кръвта се събира чрез сърдечна пункция и се обработва за определяне на грелин. Хипоталамусът се събира, съхранява в RNAlater (Qiagen, Hilden, Германия) и се обработва за PCR в реално време. Стомахът беше отворен по по-голяма крива. Лентата се изрязва вертикално отгоре надолу в средата на стомаха, съхранява се в RNAlater и се обработва за PCR в реално време. Лявата част на стомаха веднага беше фиксирана за имунохистохимия.

Експерименти с клетъчна култура, серумен шок и стимулиране

MGN3-1 54 грелиномни клетки се култивират в DMEM, допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS) и смес от 1% пеницилин (100 U/ml) и стрептомицин (100 mg/ml) (P/S) при 37 ° C при 5 ° C.% CO 2. Клетките се синхронизират, като се използва следната процедура за серумен шок. Един ден след инокулацията средата беше сменена на DMEM без серум. След 12 часа тази среда беше заменена с богата на серум среда (DMEM + P/S, допълнена с 50% конски серум) за 2 часа. След това клетките се поставят върху DMEM + 2% FBS до времето за стимулиране. В шест различни времеви точки в продължение на 24 часа, синхронизирани клетки се инкубират в продължение на 3 часа в носител (HEPES буфер), 3% пептон (ензимно разцепване на казеин, Sigma (Сейнт Луис, МО, САЩ) или 5 μM L -адреин (Sigma Клетъчната супернатанта се обработва за радиоимуноанализ на грелин (RIA), както е описано по-долу, и клетките се обработват за PCR в реално време.

Експерименти с ниска РНК интерференция

Смес от четири предварително проектирани siRNAs, насочени към последователността Bmal1, е закупена от GE Healthcare. Смес от четири siRNA конструкции, предназначени да насочват не известни гени при човек, мишка или плъх (нецелева siRNA група, GE Healthcare) беше използвана като siRNA за отрицателен контрол за откриване на странични ефекти. Трансфекцията на sihr грелинима клетки (25 nM) се извършва с интерферон (Polyplus трансфекция). След 48 часа клетките се подлагат на синхронизация със серумен шок (както е описано по-горе) и се поставят върху DMEM + 2% FBS за 16 часа. След това синхронизираните клетки се инкубират за 3 часа в носител (HEPES буфер), 3% пептон или 5 цМ L-епинефрин. Ефективността на трансфекцията се определя чрез PCR в реално време. Клетъчната супернатанта се обработва до грелин RIA.

АРИ на Грелин

Клетъчните супернатанти от клетки на грелином или плазмени проби се подкисляват (10% HCI), екстрахират се върху колона Sep-Pak C18 и се сушат под вакуум. Анализът на октаноил грелин се извършва, както е описано по-горе 19, като се използва 125 g [Tyr24] маркер на човешки грелин [1-23] и заешко анти-човешко грелин антитяло [1-8], което не разпознава неацилирания грелин. Заешко античовешко антитяло срещу грелин [14-28], което разпознава както октаноил, така и неацилиран грелин, се използва за определяне на общия грелин.

Количествена PCR в реално време

Общата РНК се изолира с помощта на Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) и се транскрибира обратно в cDNA, използвайки SuperScript II обратна транскриптаза (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Количествената PCR в реално време се извършва, както е описано по-горе 55. Последователностите на праймера са показани в Таблица 1. Относителните нива на експресия са изразени спрямо GAPDH и коригирани за променливост между цикли.

Маса в пълен размер

имунохистохимия

Стомашните тъкани (3 мишки/генотип/времева точка) бяха фиксирани с 4% параформалдехид за 2 h (4 ° C), последвано от криопротекция в 30% захароза при 4 ° C за една нощ. Криостатичните срезове (6 μm) се инкубират в продължение на 2 часа в 0,1 М PBS, съдържащ 10% магарешки серум и 0,3% Triton X-100 и след това се инкубират със заешки антиоктаноил грелин (Ab5044, разработен вътре) при 4 ° С за една нощ. Не е включен първичен контрол на антитела за тест за неспецифично свързване. След измиване, секциите бяха инкубирани с магарешка анти-заешка Alexa488 (Santa Cruz Biotechnology) в продължение на 2 часа при стайна температура. Секциите бяха монтирани в Citifluor и визуализирани под флуоресцентен микроскоп (Olympus BX41). От всеки стомах бяха анализирани две секции с помощта на софтуер за изображения на Cell ^ F (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Мюнстер, Германия). Броят на грелин-позитивните клетки се отчита в 4 произволно избрани полета (20 ×). Интензивността на оцветяването е изчислена и изразена като стойност на сивото между 0 (най-тъмния пиксел) и 0,65535 (най-яркия пиксел).

Статистически анализ

Данните са представени като средни стойности ± SEM. Анализът на циркадния ритъм беше извършен с помощта на безплатния софтуер Cosinor (версия 2.3), който изчислява циркадния период на набор от данни, използвайки процедурата на косинор, както е описано от Nelson et al. през 1979 г. 56. Всички останали данни бяха анализирани с помощта на Statistica 11 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA). Изследван е t-тест на Student за откриване на разлики между две независими групи, когато е използван едно- или двупосочен ANOVA за сравняване на повече групи. Значението беше прието на ниво 5%.

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Laermans, J. et al. Роля на часовника гена Bmal1 и стомашната грелин-секретираща клетка в циркадната регулация на системата грелин-GOAT. Sci. Представител. 5, 16748; doi: 10.1038/srep16748 (2015).

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или несъвместимо с нашите условия или насоки, означете го като неподходящо.