елементи
абстрактно
Активното разпространение и диференциация на преадипоцитите малко преди раждането и през първите години от живота създава чувствителен прозорец за мастно развитие 1, 2, 3. В резултат на това диетата на майката и вътреутробната среда могат да повлияят на съхранението на мастната тъкан и съответния риск от затлъстяване. Мастната тъкан е обект на програмиране за развитие, при което излагането на матката има траен ефект върху фенотипите на тъканите. Вариациите в диетата на майката, начина на живот и експозицията на околната среда са свързани с повишено затлъстяване по-късно в живота чрез стабилни ефекти върху растежа и метаболизма на адипоцитите 4, 5, 6. Програмирането на мастната тъкан е от особено значение за общественото здраве, тъй като затлъстяването, епидемия в САЩ и по целия свят, започва в началото на живота. Около 27% от децата в САЩ са с наднормено тегло или затлъстяване на петгодишна възраст. Затлъстелите деца са много по-често затлъстели от възрастните в сравнение с деца с нормално тегло 8, 9. Следователно намаляването на прекомерното натрупване на мазнини през първите години от живота е важен инструмент за предотвратяване на затлъстяването при възрастни. Доказателствата, че затлъстяването при раждане предсказва мазнини в по-късно детство подчертават необходимостта от разбиране на пренаталните фактори, които влияят върху развитието на мастната тъкан 10, 11 .
Avians предоставят уникален модел, при който група мастни киселини, които се доставят на ембриона, могат да бъдат специално манипулирани и тествани за ефекти върху отлагането на мазнини след излюпването (т.е. раждането). Жълтъкът осигурява повечето от мастните киселини на развиващите се тъкани в ембриона и един до два дни след излюпването, докато се постигне хранене. Профилът на мастните киселини на жълтъка може да бъде променен от източника на хранителни мазнини, предоставен на кокошките 22, 23. Например търговските яйца, обогатени с EPA и DHA, се произвеждат чрез допълване на диетата на кокошките с морски масла. Използвахме тази връзка, за да проверим хипотезата, че обогатяването на ембриони в EPA и DHA, доставяно в рибено масло (FO), намалява съхранението на мазнини при малките. Царевичното масло (CO) е използвано като еталон, тъй като съдържа сравнимо ниво на PUFA (
60%), но особено групата n-6. Всички пилета са хранени с диета на основата на CO след излюпването, за да се ограничи експерименталната манипулация до периода на ембрионално развитие. Ние показахме, че храненето на майчина ФО значително намалява затлъстяването след излюпването, без да влияе на растежа. Нашите резултати показват, че мастните киселини в майчината диета допринасят за програмирането на развитието на мастната тъкан.
резултатът
Производство на яйца и състав на мастни киселини от пилешки тъкани
Люпилнята, теглото на яйцата и теглото на пилешкото люпило са използвани за оценка на ефекта от храненето на кокошките върху качеството на яйцата, като нито едно от тях не се различава значително между CO и FO кокошите яйца (P> 0,05). Съставът на фосфолипидите, съдържащи се в мозъка и черния дроб в мастни киселини, е профилиран и качествено сравнен, за да се потвърди, че EPA и DHA са обогатени в тъканите на пилета FO в сравнение с пилета CO. Мозъкът и черният дроб са били използвани поради относителното им тегло при излюпването. Нивата на обогатяване на видовете фосфатидилхолин (PC), съдържащи EPA и DHA, са показани в таблица 1. Увеличението на нарастването (FO/CO) варира от -1,2 (18: 0/22: 6 в мозъка) до
130, 4 (PC 18: 4)./22: 6 в черния дроб), с повече от 2-кратно обогатяване за повечето видове. Тези данни потвърждават, че профилът на мастните киселини в майчиното хранене се отразява в състава на мастната киселина на получените малки по време на излюпването.
Маса в пълен размер
Ефектът на изходния източник на мастни киселини върху състава на мастните киселини, развиващ мастната тъкан, е количествено определен чрез GC-FID. Съставът на мастните киселини на общата липидна фракция на коремната мастна тъкан се анализира на 7 и 14-дневна възраст (Таблица 2). Тъканното изобилие от пет мастни киселини (палмитолеинова киселина, γ-линоленова киселина, ейкозенова киселина, ейкозадиенова киселина и докозадиенова киселина) се увеличава с възрастта (P възраст 0,05). Относителните тегла на двата склада обаче са значително намалени при FO vs. CO (P 
Обем и брой адипоцити при пилета CO и FO на възраст 7 и 14 дни. Представителни изображения на боя за мастна тъкан в корема от CO ( A, Б. ) и FO ( ° С, д ), използвана за определяне на обема на адипоцитите при 7 ( A, ° С ) и 14 ( Б., д ) д. Скала = 40 μm. Два слайда и три независими полета на слайд бяха преброени в три малки на всяка възрастова група. ( Е. ) Среден обем на адипоцитите (μm 3 × 104), ± SD; ( F ) означава адипоцитен брой (X106), ± SD. Основните ефекти на диетата, възрастта и техните взаимодействия (диета × възраст) върху обема и броя на адипоцитите са определени от ANOVA. Значителни F-тестове (P
Честотни разпределения на площта на адипоцитите (μm 2) на пилета CO и FO на възраст 7 години ( A ) и 14 ( Б. ) д. Площите на адипоцитите бяха измерени от H&E оцветени изображения и разделени на размери на кошницата. Средните честоти на клетките във всяка ямка, ± SD, са показани и сравнени чрез Т-тест. * Различно от CO, P # различно от CO, P (0,05). Черният дроб е основното място на липогенезата de novo при птиците (както при хората) 24 и играе важна роля за съхранението на мазнини при пилетата бройлери 25. Диетата не повлиява значително експресията на CPT1, ACOX1 и FASN в черния дроб (фиг. 3С), което съответства на сравними нива на триглицериди в черния дроб при пилета FO и CO (данните не са показани).
Преминаването към увеличени малки адипоцити, свързано с регулирана надолу експресия на PPARG и неговия коактиватор PPARGC1B предполага, че FO на майката намалява затлъстяването отчасти чрез инхибиране на прогресията чрез адипогенеза. EPA и DHA могат да действат като лиганди за активиране на PPARG, които се очаква да насърчават адипогенезата чрез ролята на този ядрен рецептор в организирането на диференциацията на адипоцитите. Въпреки това, in vitro проучванията показват както про-, така и антиадипогенни ефекти на EPA и DHA, които могат да бъдат причинени от колебания на клетъчните линии, протоколи за диференциация, референтни лечения и концентрации на мастни киселини от 30, 31, 32. Интересното е, че преминаване към повишена честота на малките адипоцити и повишена експресия на PPARG са описани при мазнини 1 мишки, които ендогенно синтезират n-3 PUFAs поради трансгенната експресия на нова десатураза на мастни киселини от C. elegans 33. Данните от микрочипове показват, че конститутивният синтез на n-3 PUFA в адипоцити от мишки с мазнини-1 значително потиска експресията на GATA свързващ протеин 3, който обикновено инхибира прогресията на преадипоцитите до диференциация чрез директно потискане на PPARG 34. .
16 пъти) в мастна тъкан FO vs. CO, според нашите протеомични данни. Този ензим е част от координирана ДНК деметилазна система, която регулира клетъчната съдба в развиващия се ембрион чрез епигенетична модификация 46. Експресията на APOBEC2 е свързана предимно със скелетната мускулатура, в която е свързана с диференциация на миобластите, но също така се изразява в мастна тъкан при пилета 47. Ако храненето на майката с ФО намалява затлъстяването чрез епигенетични механизми, които често са стабилни, това има важни последици за нови начини за контрол на детското (и потенциално възрастно) затлъстяване. За да се изследва тази възможност, са необходими последващи проучвания, за да се характеризират моделите на метилиране и други епигеномни характеристики на храненето на майката с FO.
В обобщение, нашите данни показват, че консумацията на майчино рибено масло намалява отлагането на мастна тъкан при потомството. Нашето проучване беше ограничено до първите две седмици от живота и са необходими последващи експерименти, за да се определи колко дълго продължава този ефект, докато малките узреят. Тези резултати допълват скорошни проучвания при хора, които свързват LC n-3 PUFAs в майчината диета с намаленото тегло на мазнините при деца. Поради това те подчертават потенциала за намаляване на натрупването на мазнини и потенциалния риск от детско затлъстяване чрез пренатална диетична намеса.
методи
Диети и отглеждане
Събиране на кръв и тъкани
Пилетата бяха евтаназирани с CO2 задушаване. По две малки от всяка група бяха жертвани, когато черният дроб и мозъкът бяха излюпени за анализ на липидите. Пробите от всяка тъкан се замразяват бързо и се съхраняват при -80 ° С. Останалите пилета се умъртвяват на възраст 7 и 14 дни. По време на евтаназия кръвта се събира чрез сърдечна венепункция и се прехвърля в 10 ml серумни сепарационни епруветки (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Серумът се отделя чрез центрофугиране и се съхранява при -80 ° C до анализ на циркулиращите метаболити. Коремните и бедрените (подкожни) места на мастните депа се дисектират и претеглят като индекси на затлъстяване. След това проби от всяко депо и черен дроб се замразяват бързо в течен азот и се съхраняват при -80 ° С. Пробите от коремната мастна тъкан се фиксират за 24 часа при 4 ° C в параформалдехид (4%), за да се определи хистологично размерът на адипоцитите.
Серумни метаболити
Наличните в търговската мрежа колориметрични тестови комплекти бяха използвани за измерване на нивата на серумна глюкоза (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) и нивата на неестерифицирани мастни киселини (NEFA) (Wako Chemicals, Neuss, Германия).
Анализ на мастни киселини
Анализ на фосфолипидите
Съставът на мастните киселини на видовете фосфатидилхолин в мозъка и черния дроб, събрани при излюпването (n = 2/диета) и в коремната мастна тъкан, събрана на 7-дневна възраст (n = 5/диета), беше анализиран с помощта на UltraHigh Performance Liquid Chromatograph (UHPLC) ) -Г-ЦА. (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA). Пробите от тъкани (100 mg) се смилат на прах в течен азот с помощта на хоросан. Фосфолипидите бяха извлечени с помощта на модифициран протокол Bligh и Dyer 65. Изсушените екстракти се суспендират отново в 300 μl метанол/хлороформ (9: 1) за UHPLC-MS анализ, както е описано по-горе 66. Видовете липиди бяха идентифицирани с помощта на точни m/z и времена на задържане. Липидни стандарти (Avanti Polar Lipids, Alabaster AL) от всеки клас фосфолипиди бяха използвани за проверка на времената на задържане. Всички йонни фрагменти бяха използвани, за да се потвърди, че фосфатидилхолините съдържат DHA и EPA като ацилни вериги. За всички сканирания на йонна фрагментация разделителната способност беше 140 000 с обхват на сканиране 100-1500 m/z. Нормализираната енергия на сблъсъка е 30 eV със стъпкова енергия на сблъсък от 50%. Липидите бяха идентифицирани чрез фрагменти от тях, използвайки софтуера Xcalibur (Thermo Fisher Scientific, Сан Хосе, Калифорния). Анализът на данните е извършен с помощта на софтуера Maven 67 .
Размер на адипоцитите
Проби от коремна мастна тъкан от три диетични птици във всяка от двете възрастови категории бяха вградени, разделени и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E; две предметни стъкла/птица), за да се определи размерът на адипоцитите, както е описано по-горе. Използвани са три птици със стойности на затлъстяване, най-близки до средната затлъстяване във всяка диета/възрастова група. Накратко, изображения на три независими полета на слайд бяха заснети на всеки слайд с 20-кратно увеличение с помощта на Advanced Microspy Group EVOS XL Core Microcope (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). За последователност едно и също лице извърши всички измервания. Фигура J (версия 1.48, Национален здравен институт) е използвана за определяне на площта на адипоцитите (μm 2), като се използва настройка на микроскоп от 2.8 μm/пиксел и се използва ограничението, че измерванията трябва да надвишават 500 μm 2. Разпределението на честотата се генерира чрез групиране на адипоцитите в кладенци въз основа на площта и преброяване на честотата на клетките във всяка ямка. Използван е стандартен метод за изчисляване на обема на адипоцитите и числото 68.
PCR тест в реално време
Обща РНК се изолира от приблизително 200 mg коремна мастна тъкан и черен дроб от пет малки на 14 дни във всяка диетична група, използвайки Invitrogen ™ TRIzol ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Използвани са пет птици със стойности на затлъстяване, най-близки до средната затлъстяване във всяка диета. CDNA се синтезира от 500 ng обща РНК в 20 μl реакции, използвайки iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Предвидени и валидирани праймери за количествена PCR в реално време (QPCR) са закупени от Qiagen (Quantitect; Germantown, MD). QPCR се извършва в три екземпляра за всяка проба, като се използва iQ SYBR Green Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), както е описано по-горе 53. Експресионните нива на желаните гени бяха нормализирани спрямо експресията на семейството на домейна TBC1, член 8 (TBC1D8), използван като домакиня.
протеомика
Приблизително по един g коремна мастна тъкан от всяко от трите малки на диета се смила на прах в течен азот, от който приблизително 60 mg се използват за екстракция на протеини. Протеините се екстрахират с помощта на протокол за екстракция на протеини без метанол, хлороформ и хлороформ (2: 1), който е проектиран за богати на липиди тъкани и въз основа на метода Bligh и Dyer 70. Протеините се утаяват от водната фракция, като се използва трихлороцетна киселина и се усвояват със стъпаловиден трипсин. Приблизително 2 mg протеолитични пептиди са получени от всяка проба след пречистване. 50 μg аликвотни части от тези пептиди бяха използвани за 2D-LC-MS/MS протеомни измервания на LTQ Orbitrap масспектрометър (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), както е описано по-горе 71. MyriMatch v2.1.111 72 е използван за търсене на суровия масов спектър спрямо прогнозираната база данни за протеини, за да се идентифицират напълно триптични пептиди, които след това са групирани в подходящите протеини с IDPicker v.37. За по-нататъшен анализ бяха разгледани само идентифициране на протеини с най-малко два идентифицирани пептидни спектъра и максимална стойност q 0,02. Пептидните фрагменти бяха картографирани на протеини в генома на Gallus gallus (V3.0) с помощта на Uniprot.
Статистически анализ
Статистическите анализи бяха извършени с помощта на SAS (V 9.4). Преди статистическите тестове данните бяха проверени за нормалност с помощта на Shapiro-Wilks. Теглото на тялото и мазнините, серумните метаболити, съставът на мастните киселини в тъканите, средният размер на адипоцитите и броят на адипоцитите бяха анализирани, използвайки смесен ANOVA модел с термини за диета, възраст и тяхното взаимодействие (възраст X). След значителни F-тестове (P 74 за нормализиране на разпределението на данните. Извършен е функционален анализ на диференциално обилни протеини, използвайки опциите за функционално анотиране и картографиране на пътя, намерени в базата данни за анотации, визуализация и интегрирано откриване (DAVID, V 6.8) 75. Всички статистически данни тестовете бяха извършени с използване на P-стойности ≤ 0,05 като критерий за статистическа значимост.
Наличност на данни
Наборите от данни, генерирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответния автор при разумна заявка
История на промените
Благодаря
Тази работа беше подкрепена от финансиране на BHV от Центъра за върхови постижения по болестите по добитъка и човешкото здраве, Колеж по ветеринарна медицина на Университета в Тенеси и от AgResearch, Институт по земеделие на Университета в Тенеси. Авторите биха искали да признаят на WM Keck Metabolomics Research Laboratory, State University of Iowa, за анализите на мастните киселини и да благодарят на Dr. Майкъл О. Смит и Dr. Джей Уилън за приноса им в проекта.
Електронен допълнителен материал
Допълнителна информация и данни
Коментари
Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.