популация

  • елементи
  • абстрактно
  • Заден план:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Основното
  • резултатът
  • Размер на популацията на NK клетки
  • Експресия на интелектин-2 иРНК в NK клетки, изолирани от PBMC
  • Цитотоксичност на NK клетки
  • Експресия на NK-свързани гени в NK клетки, изолирани от PBMC
  • дискусия
  • методи
  • химикали
  • BLF
  • Хранително лечение и протокол за животни
  • Вземане на проби
  • PBMC изолация
  • Пълна изолация на клетки от далак и MLN
  • Изолиране на NK клетки и фенотипна идентификация за чистота
  • Тест за цитотоксичност на NK клетки чрез поточна цитометрия
  • Фенотипна идентификация на мононуклеарни клетки от кръв и клетки от MLN и далак
  • Експресия на NK клетъчен ген
  • Статистически анализ
  • Отчет за финансова подкрепа
  • разкриване
  • Допълнителна информация
  • Файлове на Powerpoint
  • Допълнителна фигура S1.

елементи

абстрактно

Заден план:

Естествените клетки-убийци (NK) са част от вродената имунна защитна система и нивата им варират между кърмачета и бебета (FF). Лактоферин (Lf) модулира цитотоксичността на NK клетки ex vivo. Ние предположихме, че диетичният говежди Lf (bLf) ще увеличи популацията на NK клетки и цитотоксичността.

методи:

Прасенца се отглеждат със свиня (SR), FF или 1 g/l bLf (LF) в продължение на 21 дни. Кръвните NK клетки (CD3 - CD4 - CD8 +) (мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC)), далак и мезентериални лимфни възли (MLN) се определят чрез поточна цитометрия. NKMCs PBMCs бяха тествани за цитотоксична активност срещу K562 целеви клетки ex vivo в присъствието на среда (нестимулирана), интерлевкин-2 или bLf. Експресията на NK клетъчна иРНК се определя чрез обратна транскрипция-количествена PCR.

резултатите:

Прасенцата SR и LF са имали повече NK клетки в MLN (P = 0,0097) и далак (P = 0,0980), отколкото прасенца FF. В PBMC, прасенцата SR са имали повече NK клетки, отколкото прасенца FF (P = 0,0072); LF прасенца са средни и не се различават от FF или SR прасенца. Експресията на интелектин-2 иРНК в NK клетки е 2,5 пъти по-висока (P = 0,0095) в LF от прасенца SR или FF. NK клетките при прасенца в Словашката република показаха по-високи (P

Изобилието на интелектлин-2 иРНК е по-високо в естествените клетки убийци на 21-d-възрастни прасенца, хранени с bLf (LF, n = 3), отколкото при свине майки, отглеждани на свине майки (SR, n = 7) или хранени формули (FF, n = 6 ).) животните. Нормализираните стойности за интелектин-2 бяха изчислени чрез разделяне на средната стойност на целевото количество със средното количество на референтния ген (пептидилпролил изомераза А). За всяко измерване се изчислява кратно на разликата чрез разделяне на нормализираните целеви стойности на средната нормализирана целева стойност за прасета FF. Данните са изразени като средната стойност ± SD, умножена по разликата в сравнение с FF животни. * Р

Цитотоксичност на клетките с естествени убийци (NK), изолирани от 21-дневни стари свине майки (SR; n = 11; черно), хранени с формула (FF; n = 14; бели) и bLf-хранени (LF; n = 11; сиви) прасенца. Мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC) NK клетки са или нестимулирани (Unst), или стимулирани с интерлевкин-2 (IL-2) (20 ng/ml) или Lf (25 μg/ml) и инкубирани в продължение на 48 часа с маркиран с DiOC18 K562 целеви клетки в съотношение на ефектите към целевите клетки 10: 1. В края на инкубацията се добавя пропидиев йодид (PI) за маркиране на мъртвите клетки. Цитотоксичността се отчита като убити целеви клетки (PI + DiOC 18 +) като процент от общите целеви клетки (DiOC 18 +). Данните са изразени като средна стойност ± SD. Пълният модел на обобщен линеен модел (GLM), P †, представлява значителни разлики между диетите. bLf, говежди лактоферин.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Експресия на NK-свързани гени в NK клетки, изолирани от PBMC

За да се идентифицират възможните молекулярни механизми, които биха могли да допринесат за намаляване на цитотоксичната активност на NK клетки от FF и LF животни, е извършена обратна транскрипционно-количествена PCR върху РНК, извлечена от нестимулирани периферна кръв CD3 - CD4 - CD8 + NK клетки ( снимка 3). ). Излишъкът на перфорин мРНК, ефекторна молекула за NK клетки, е три пъти и шест пъти по-нисък в NK клетки от FF и LF прасенца, съответно, отколкото в mRNA от SR прасенца (P = 0,0038, Фигура 3а ). В допълнение, експресията на D2 рецептора за NK2 членове на група 2 (NKG2D), активиращ рецептор, открит в NK клетките и известен като подгрупа К рецептори 1 за лектинови клетки Killer тип 1 (KLRK1), е 3,5 пъти по-ниска при NK клетки от FF животни, както при SR животни, докато експресията на NKG2D рецепторния ген в NK клетките на LF животни е умерена и не се различава значително от никоя група ( Фигура 3б ).

Излишък D (NKG2D) перфоринов рецептор ( а ) и член на NK група 2 ( б ) изобилие на иРНК в естествени клетки убийци, изолирани от 21-d-стари свине-майки (SR, n = 7), хранени с формула (FF, n = 4) -5) и bLf-хранени прасенца (LF, n = 3). Нормализираните стойности за целевите гени бяха изчислени чрез разделяне на средната стойност на целевото количество със средното количество на референтния ген. За всяко измерване се изчислява кратно на разликата чрез разделяне на нормализираните целеви стойности на средната нормализирана целева стойност за прасета FF. Данните са изразени като средна стойност ± SD. Различните горни индекси (*, †, ‡) показват значителни разлики в P - CD4 - CD8 +), използвани в това проучване за ниски нива на CD56. Популация от CD16 + NK клетки при хора, които проявяват цитотоксична активност и производство на интерферон-γ.

Бъдещите експерименти за оценка на няколко NK клетъчни функции ще изяснят дали NK клетките от FF прасенца имат намалена ефекторна функция, лош отговор на стимулация или активно потискане на цитотоксичността. Например, измерването на производството на гранзим, перфорин или интерферон-γ в отговор на омрежване на рецептори или прилагане на моноклонални антитела към NKG2D ще определи дали клетъчните отговори на стимулацията се различават. Експресията на тези протеини може да бъде измерена чрез поточна цитометрия, ензимно свързан имуносорбентен точков анализ или ензимно свързан имуносорбентен анализ. Измерването на калциевия поток след такова лечение също би определило дали NK клетките от прасенца в различните групи на лечение са еднакво способни да реагират на стимулация чрез пътища на сигнална трансдукция. Намалената експресия на Fas клетъчната повърхност, медиатор на апоптоза, би показала клетки с намален ефектор капацитет. Познаването на специфичния етап на NK клетъчната функция, който се влияе от неонаталната диета, може да позволи разработването на подходящи интервенции. Следователно, въз основа на наблюденията, направени в този документ, този ред на изследвания трябва да продължи.

Като цяло диетата има значителен ефект върху популацията и активността на NK клетките. Прасенцата, хранени с кърма, имат по-голяма популация от NK клетки в кръвта и имунните тъкани и по-голяма цитотоксична активност (PBMC) в сравнение с прасенца, които са били FF. Въпреки това, общите ефекти на bLf върху развитието на NK клетки в това проучване са неубедителни. Диетичното добавяне на bLf не повишава цитотоксичността на NK клетките; фактът, че прасенцата LF имат по-голям брой NK клетки на периферна кръв с повишена експресия на LfR, може потенциално да подобри имунната защита на новороденото. В допълнение, добавката bLf за повече от 21 дни или повече може да бъде по-ефективна за повишаване на вродения имунен отговор при тези животни, тъй като дозата, използвана в това проучване (1 g/l), е в долния край на това, което присъства при хората кърма (

2,1 g/l). Следователно са необходими бъдещи проучвания, за да се определи дали имунната регулаторна функция на bLf върху активността на NK клетките зависи от определен набор от условия, т.е. патогенен стимул, възраст или вид. Тъй като NK клетките са важна първа защитна линия срещу инфекция, разбирането на факторите, които увеличават техния брой и подобряват способността им да убиват, може да ни позволи да защитим по-добре децата от FF от инфекция чрез диетични средства.

методи

химикали

Всички химикали са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури), освен ако не е посочено друго.

Прахообразен bLf (98% чистота) е получен от DMV International (FrieslandCampina, Холандия). Общото съдържание на желязо е 120 mg/kg прах, което би представлявало 11,9% насищане, ако цялото желязо е свързано с bLF. bLf се разтваря в двойно дестилирана дейонизирана вода до концентрация 100 g/l. По време на приготвянето на формулировката, 10 ml от този разтвор се добавят към 1 l от състава до крайна концентрация от 1 g/l bLf.

Хранително лечение и протокол за животни

Вземане на проби

На 21-ия ден след раждането прасенцата се успокояват чрез интрамускулно инжектиране на Telazol (7 mg/kg телесно тегло; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA) и кръв се събира чрез интракардиална пункция във вакуумни епруветки, съдържащи хепарин (BD Biosciences, Сан Хосе ), Калифорния) за изолиране на PBMCs. След това прасенцата се умъртвяват чрез интракардиално инжектиране на натриев пентобарбитал (72 mg/kg телесно тегло, Fatal Plus; Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI). След евтаназия се вземат проби от далак и MLN за пълна клетъчна изолация.

PBMC изолация

Кръвта се разрежда 2: 1 с RPMI-1640 (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY), наслоява се върху Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Piscataway, NJ) и се центрофугира при 400 g в продължение на 40 минути при 20 ° C. PBMCs събрани от градиентния интерфейс. Червените кръвни клетки се лизират, използвайки лизисен буфер (0,15 М NH 4 Cl, 10 mmol/L KHCO 3 и 0,1 mmol/L Na2 EDTA). След това PBMC се измиват три пъти в буфер за промиване, съставен от буфериран физиологичен разтвор на Hank (без Ca 2+, без Mg 2+ (HBSS; Invitrogen, Gibco), допълнен с 2% BSA, 1 mmol/L Na 2 EDTA, 50 μg/ml гентамицин (Invitrogen, Gibco), 1000 U/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин). PBMCs бяха суспендирани в пълен RPMI-1640 (10% FBS, 2 mmol/l глутамин, 50 μg/ml гентамицин, 1 mmol/l натриев пируват, 20 mmol/l HEPES (Invitrogen, Gibco), 1000 U/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин). Броят на жизнеспособните клетки се определя чрез преброяване след оцветяване с трипан синьо (Invitrogen, Gibco). След това клетките бяха фенотипизирани и количествено определени чрез поточна цитометрия или използвани за изолиране на NK клетки, както е описано по-долу.

Пълна изолация на клетки от далак и MLN

Пробите от далак и MLN бяха събрани и съхранявани върху лед в буфер за събиране на антибиотици до обработката. Тъканите се измиват три пъти (PBS (Invitrogen, Gibco), 50 μg/ml гентамицин, 1000 U/ml пеницилин и 100 μg/ml стрептомицин). Измитите тъкани се поставят в С-епруветки (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) с 10 ml буфериран физиологичен разтвор на Hank и се нарязват с помощта на фин MACS (Miltenyi Biotec). Получените клетъчни разтвори се промиват през 100 μm (BD Falcon, Сан Хосе, Калифорния), последвано от 40 μm мембранен филтър (BD Falcon). След лизис на червените кръвни клетки, изолираните клетки се промиват три пъти в промивен буфер и се суспендират в пълен RPMI-1640. Броят на жизнеспособните клетки се определя чрез преброяване след оцветяване с трипан синьо (Invitrogen, Gibco). След това клетките бяха фенотипизирани чрез поточна цитометрия, както е описано по-долу.

Изолиране на NK клетки и фенотипна идентификация за чистота

Тест за цитотоксичност на NK клетки чрез поточна цитометрия

Фенотипна идентификация на мононуклеарни клетки от кръв и клетки от MLN и далак

Фенотипите на периферната кръв, MLN и далака NK клетки се наблюдават чрез поточна цитометрия, като се използва панел от флуоресцентно маркирани моноклонални антитела. NK клетки бяха идентифицирани с използване на миши анти-свински CD3: PECγ5 (Southern Biotech), миши анти-свински CD4: FITC (Southern Biotech) и миши анти-свински CD8: PE (Southern Biotech). Всички процедури за оцветяване се извършват върху лед и се полагат специални грижи, за да се избегне ненужно излагане на светлина. Накратко, един милион клетки на кладенче бяха блокирани със смес от 5 μg/ml немаркиран анти-CD16 (клон G7; AbD Serotec, Raleigh, NC) и 5% миши серум (Southern Biotech), за да се предотврати неспецифично свързване на антитела клетките. Анти-CD3, анти-CD4 и анти-CD8 антитела се добавят към ямките, инкубират се в продължение на 15 минути, центрофугират се и след това супернатантата се аспирира. Клетките се промиват два пъти с буфер за оцветяване (PBS, без Ca 2+, без Mg 2+, 0,1% натриев азид и 1% BSA (Invitrogen, Gibco)) и след това се фиксират с 2% параформалдехид. Оцветяването се оценява с помощта на поточен цитометър LSRII (BD Biosciences). Относителният процент на популацията на NK клетки се определя с помощта на софтуера FlowJo (версия 7.0, FlowJo; TreeStar). NK клетките са идентифицирани като CD3 - CD4 - CD8 + събития (30) и са изразени като процент от CD3 събития.

Експресия на NK клетъчен ген

Общата РНК беше извлечена и пречистена от NK клетки, изолирани от PBMC с реагент TRIzole (Invitrogen, Grand Island, NY), съгласно протокола на производителя. РНК се определя количествено спектрофотометрично, като се използва Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Rockford, IL) при 260 nm. Общо 10 милиона NK клетки бяха използвани за екстракция и предоставени

800 - 1000 ng/μl РНК. Концентрацията на РНК се коригира до 0.25 μg/ml с вода без RNase (Invitrogen) и качеството на РНК се анализира с помощта на Bioanalyzer (Модел 2100; Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния) в WM Keck Center в Университета на Илинойс. Всички проби имаха номер на целостта на РНК> 6.

Обратната транскрипция беше извършена с помощта на термичен циклер Eppendorf (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Всяка реакция съдържа 3 μg обща РНК и 10 μl смес от комплект за обратна транскрипция на cDNA с висока производителност (Applied Biosystems, Foster City, CA), съдържащ 100 mmol/L дезоксирибонуклеотиден трифосфат (dNTP), 10X RT буфер, 10X RT произволни праймери, MultiScribe РНК-инхибитор на обратната транскрипция и обработена с диетилпирокарбонат (DEPC) вода (Invitrogen) в краен обем от 20 μl.

Количествената PCR в реално време се извършва за ITLN-2 (Ss03374218_m1), KLRK1 (NKG2DR; Ss03394782_g1) и перфорин (Ss03373694_m1) и пептидилпролил изомераза A (Ss03392377_m1) с помощта на Taqlied PCR Biosyst. Пробите бяха подадени на общо 40 амплификационни цикъла на цикъл и интензивността на флуоресценция беше установена с помощта на машина Taqman ABI 7900 (Applied Biosystems). Пептидилпролил изомераза А се използва като референтен ген (31). Резултатите бяха изразени, използвайки метода на относителната стандартна крива. Накратко, бяха направени серийни разреждания (1: 5 до 1:15, 625) от запас от сборна свински NK кДНК от свински клетки и течаха върху всяка плака. Всяка проба се пуска в три екземпляра с праймери за оценка на целевия ген и пептидилпролил изомераза А. Нормализираните стойности за всяка мишена се изчисляват чрез разделяне на средната стойност на целевото количество на средната стойност на пептидлипролил изомераза А. Разликата в гънките се изчислява за всяко измерване чрез разделяне на нормализираните целеви стойности на нормализираната проба от калибратора (в този случай средната стойност за групата FF). Всички проби, които са били тествани за статистически разлики, са пуснати на една и съща плоча.

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на обобщения линеен модел на Proc в рамките на SAS (Версия 9.2; SAS Institute, Cary, NC). Моделът за NK клетъчна популация и анализи на генна експресия съдържа диетата като основен ефект. Моделът за цитотоксичност на NK клетките съдържа ефекта от диетата, лечението и взаимодействието диета × лечение. Нормалното разпределение на данните се потвърждава от теста за нормалност в рамките на SAS и число на Шапиро - Уилк ≥0,75 показва, че стойностите са нормално разпределени. Данните се отчитат като средна стойност ± SD. Сравнения с P