полиморфизмът

  • абстрактно
  • Основното
  • МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
  • Групи пациенти
  • Полимеразна верижна реакция (PCR)
  • Анализ на полиморфизма на дължината на рестрикционния фрагмент
  • Статистически анализ
  • РЕЗУЛТАТИТЕ
  • Характеристики на населението
  • Честоти на генотипове и ИЛИ
  • ДИСКУСИЯ

абстрактно

Предназначение: Ролята на генетичната податливост към аденокарцином на хранопровода и неговата прекурсорна лезия на хранопровода на Барет не е напълно изяснена. Това проучване изследва ефекта на полиморфизмите в гените на манганова супероксиддисмутаза (MnSOD) и NAD (P) H гени: хинон оксидоредуктаза 1 (NQO1) при модулиране на риска от развитие на хранопровода на Барет или аденокарцинома на хранопровода.

Методи: Общо 584 пациенти (146 хранопровода, 200 хранопровода на Barrett, 144 хранопровода на аденокарцином и 94 контроли) са генотипирани за MnSOD C14T и NQ01 C609T полиморфизми чрез полимеразна верижна реакция и анализ на полиморфизъм на дължина на рестрикционен фрагмент.

Резултати: Генотипът NQO1 TT е по-рядко срещан при пациенти с хранопровод на Барет (2,0%) и аденокарцином на хранопровода (1,4%) в сравнение с пациенти с хранопровод (7,6%) и контролни групи (5,4%). След корекция по пол, възраст, индекс на телесна маса, симптоми на рефлукс и тютюнопушене, пациентите с хомозиготен генотип TT 4 са имали 5,5 пъти намален риск от развитие на хранопровода на Барет (вероятност = 0,22, 95% доверителен интервал = 0,07-0,76, P = 0, 01) и 6, 2-кратно намален риск от аденокарцином на хранопровода (коефициент на вероятност = 0,16, 95% доверителни интервали = 0, 03–0,94, P = 0,04) в сравнение с лица с генотипове TC и CC. Не са наблюдавани значителни разлики между групите за MnSOD полиморфизъм (P = 0,289).

Заключения: Като цяло, резултатите от това проучване показват, че генотипът NQO1 TT може да предложи защита срещу рефлуксни усложнения като хранопровода на Барет и аденокарцинома на хранопровода.

Основното

Повечето аденокарциноми на хранопровода (EACs) възникват като последния етап от многоетапния път, започващ с метапластична промяна в сегмент на лигавицата на хранопровода, състояние, известно като хранопровод на Барет (BE). 1 В тази премалигнена фаза плустриратизираният езофагеален епител придобива подобни на червата колоновидни характеристики, включително наличието на бокалови клетки. През последните 30 години много епидемиологични проучвания установиха причинно-следствена връзка между гастроезофагеалната рефлуксна болест (ГЕРБ) и развитието на BE и EAC, като рискът нараства при лица с най-голяма тежест, продължителност и честота на рефлукса. 3, 4 Въпреки ясната връзка между рефлукса и риска от BE и EAC, само малка част от пациентите с ГЕРБ развиват усложнения, свързани с рефлукса и само 0,5% от пациентите с BE редуцират рак всяка година. Досега причините за тази хетерогенност в отговор на рефлукс трябва да бъдат изяснени.

Като се има предвид този мутагенен рефлуксен потенциал, хетерогенността на резултатите от ГЕРБ и ВЕ може да бъде свързана с индивидуални вариации в пътищата на антиоксидант, детоксикация и възстановяване на ДНК, което може да повлияе на риска от придобиване на генетични промени, наблюдавани при прогресията на ВЕ към злокачествено заболяване. са изследвали връзката между специфични генетични полиморфизми и езофагеален плоскоклетъчен карцином при високорискови азиатски популации. 15-19 Въпреки това към днешна дата са публикувани само няколко доклада за генетичната чувствителност към EAC в западните страни; все по-често се разглежда ролята на генетичната податливост към BE.

В това проучване ние изследвахме ролята на генетичните полиморфизми в мангановите супероксидни дисмутази (MnSOD) и NAD (P) H: хинон оксидоредуктаза 1 (NQO1) за модулиране на чувствителността към BE и EAC в британската популация. MnSOD е избран за изследване, тъй като този ензим осигурява важна антиоксидантна защита срещу супероксидни аниони, произведени по време на възпалителни процеси. 8, 20 Полиморфизмът на MnSOD C14T води до промяна в аминокиселината аланин (С алел) до валин (Т алел) в сигналния пептид, отговорен за транспортирането на зрелия протеин до правилния субклетъчен сайт 21, 22 и е свързан с чувствителност към различни видове рак. 23-27 Фазата II детоксикиращ ензим NQO1 е избран, тъй като той реагира с редица природни и синтетични съединения, включително хинони, хинонови епоксиди, хинонимини, нафтохинони, метиленово синьо, азо и нитро съединения 28 и следователно може да метаболизира широк спектър от канцерогени, съдържащи се в рефлукс. TT генотипът съответства на нулев фенотип, тъй като води до производството на мутирал протеин с намалена активност и удължен полуживот. 29 Предишни проучвания показват връзка между този полиморфизъм и редица видове рак, включително гастроезофагеални злокачествени заболявания. 30, 31

Резултатите от нашето проучване показват, че полиморфизмът NQ01 C609T може да модулира вероятността пациентите с гастроезофагеален рефлукс да развият BE и EAC, докато не е установена връзка между полиморфизма MnSOD C14T и риска от тези заболявания.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Групи пациенти

След информирано съгласие общо 584 пациенти са приети в болница в Йоркшир, Обединеното кралство в специализирана диспепсична клиника и клиника за ендоскопия Barrett на два третични референтни центъра (болница Royal Hallamshire, Sheffield и Leeds General Infirmary, Лийдс) между 2000 и 2003 г. При набиране на персонал беше събрана информация за възраст, пол, симптоми на рефлукс, индекс на телесна маса (ИТМ), история на тютюнопушенето, консумация на алкохол и лекарства. ДНК се извлича от кръв (n = 470) или от нормални проби на биопсия на хранопровода (n = 114), като се използва методът фенол/етанол или комплектът TriReagent (Sigma-Aldrich Ltd., Gillingham, UK).

Полимеразна верижна реакция (PCR)

Генотипизирането на полиморфизмите NQ01 C609T и MnSOD C14T се извършва чрез PCR и анализ на полиморфизъм на фрагменти с ограничена дължина, както е описано по-рано, 23, 30 с малки модификации. Накратко, 1 μl ДНК се амплифицира с 1x PCR буфер (Qiagen Ltd., Crawley, UK), 12,5 pmol напред и назад праймери (InVitrogen Ltd., Paisley, UK), 0,5 единици HotStarTaq ДНК полимераза (Qiagen Ltd.) и 200 μM дезоксирибонуклеозид трифосфат (InVitrogen Ltd.), в общ обем 20 μl, като се използва термоциклер GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Warrington, UK). Последователностите на праймера бяха 5'aagcccagaccaacttct3 'и 5'atttgaattcgggcgtctgctg3' за NQ01 и 5'accagcaggcagctggcgccgg3 'и 5'gcgttgatgtgaggttccag3' за MnSOD. Реакционните условия бяха за 15 минути при 95 ° C за активиране на HotStarTaq, последвани от 38 цикъла от 30 секунди при 95 ° C, 30 секунди при 60 ° C и 30 секунди при 72 ° C и 7 минути за окончателно удължаване при 72 ° C Във всяка партида за амплификация бяха включени контролни проби, на които беше пропусната ДНК. Успехът на PCR реакцията и липсата на кръстосано замърсяване в отрицателните контроли бяха проверени чрез 1.5% агарозна гел електрофореза. Очакваният размер на PCR продуктите е 174 bp за NQ01 и 107 bp за MnSOD .

Анализ на полиморфизма на дължината на рестрикционния фрагмент

Десет микролитра PCR продукт се усвояват за една нощ при 37 ° С с 5 единици HinfI (NQ01) или NgoM IV (MnSOD) (New England Biolabs Ltd., Hitchin, UK) в общ обем от 20 μl. Генотиповете се визуализират чрез 3% (NQ01) или 4 (MnSOD) агарозен гел електрофореза на PCR продукта в 0.5x етилендиаминтетраоцетна киселина трисборатен буфер, съдържащ 0.5 μg/ml етидиев бромид (Sigma-Aldrich Ltd., Gillingham, UK). За полиморфизма NQ01, алелът С е визуализиран като лента от 174 bp, докато алелът T е разцепен на два фрагмента от 122 и 52 bp (фиг. 1). Алелът Т на полиморфизма MnSOD е идентифициран чрез нетретиран продукт от 107 bp, докато алелът C произвежда два фрагмента от 89 и 18 bp (фиг. 2). След потвърждаване на правилния генотип чрез секвениране (GRI Genomics, Rayne, UK), една проба за всеки от трите генотипа беше включена във всички амплификационни и разградителни партиди като качествен контрол. Генотипирането се повтаря за 10% от пробите и показва последователни резултати във всички случаи.

NQ01 C609T генотипове, визуализирани чрез 3% агарозна гел електрофореза. Алелът С се появява като лента от 174 bp, докато алелът T се обозначава с два фрагмента от 122 и 52 bp. A, CC контрол; В, CT контрол; C, TT контрол; N, чек без табела; М, стълба 100 bp. Цифрите в горната част показват усвоения PCR продукт за всеки индивид.

Изображение в пълен размер

Генотипове на MnSOD, открити чрез електрофореза в 4% агарозен гел. Алелът Т се визуализира като неразграден фрагмент от 107 bp, докато алелът C се обозначава с два фрагмента от 89 и 18 bp. A, CC контрол; Контрол В, ТТ; С, CT контрол; Стълба M1 и M2, 100 bp; N, проверете без шаблон. Цифрите в горната част показват усвоения PCR продукт за всеки индивид.

Изображение в пълен размер

Статистически анализ

Разликите в категориалните променливи (пол на мъже/жени, никога/никога не пушачи) между проучваните групи бяха оценени с помощта на теста на Pearson χ 2. Тестът на Крускал-Уолис е използван за сравняване на непрекъснати променливи (възраст, ИТМ и прием на алкохол), тъй като тези променливи не отговарят на нормалното разпределение, както е показано от теста на Колмогоров-Смирнов. Съотношенията на курсовете (OR) и 95% доверителни интервали (CI), свързани със специфични генотипове, са изчислени чрез множествена логистична регресия със и без корекция за пол, възраст, ИТМ, рефлукс и статус на пушене. Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуера SPSS 12.0 (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс) и STATA 7 (STATA Corporation, College Station, TX). В допълнение, честотите на генотипа бяха тествани за равновесие на Харди-Вайнберг, използвайки Тест за добро състояние 2 (Graphpad Instat, 2, 05). P 0,05), с изключение на полиморфизма NQ01 при пациенти с езофагит (P = 0,005). Не са наблюдавани значителни разлики в честотата на генотипа за полиморфизъм на MnSOD между групите (P = 0,289) (Таблица 2). За разлика от тях, честотите на полиморфизъм NQ01 C609T (P 0, 500) (Таблица 3).

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

ДИСКУСИЯ

Симптомите на рефлукс са често срещани при западните популации, 34, 35, но когато тези пациенти са насочени за ендоскопия, някои нямат видима патология, някои са развили езофагит, а други са развили предраково поражение на BE, което е свързано с повишен риск на прогресия към EAC. В опит да подобри прогнозата на EAC чрез ранна диагностика, Американският колеж по гастроентерология препоръчва включването на всички пациенти с BE в ендоскопски програми за проследяване. 37 Въпреки това, разработването на генетични маркери за идентифициране на подгрупа от пациенти с БЕ, които са по-склонни да прогресират до рак, би позволило наблюдението да бъде специално насочено към лица с по-висок риск. Следователно целта на това проучване беше да се оцени дали генетичните полиморфизми в гените, свързани със защитата на свободните радикали и детоксикацията с ксенобиотици, биха могли да допринесат за хетерогенност в развитието на патологията на хранопровода и дали те могат да се използват като индикатори за по-висок риск от прогресия.

Резултатите от нашето проучване са в съответствие с резултатите от предишни изследвания, които показват подобен защитен ефект на нулевия Т алел срещу полиморфизъм Т на рак на белия дроб с намален риск от рак на белия дроб. Рак Res 1999; 59: 3045–3048. "Href =/articles/gim200757 # ref38 aria-label =" Reference 38 "data trace = click data trace = link> 38-41 вероятно поради намалени активиращи ефекти на NQO1 върху канцерогените 41. Други изследвания обаче предполагат, че намаляването на NQ01 активност, свързана с алел Т, може да предразположи към рак на стомаха, дебелото черво, пикочния мехур, шийката на матката, 44 и гърдата 45. Явната контрастна роля на този полиморфизъм при различни злокачествени заболявания може да отразява сложните ефекти на NQ01 върху метаболизма на канцерогена и способността му да изпълнява както антиоксидантна, така и прооксидантна активност. намерени в дизел exh aust са например активирани от NQ01, 29, 46

Що се отнася до ролята на NQ01 в карциногенезата на хранопровода, в едно проучване генотипът TT е свързан с повишен риск от плоскоклетъчен карцином. 31 Контрастът между защитния ефект на високата активност на NQ01 при плоскоклетъчен карцином на хранопровода и нашите открития за предразполагаща роля към EAC може да отразява различната етиология на тези два хистологично различни вида рак на хранопровода. Например, NQ01 може да активира специфични канцерогени, които участват изключително в развитието на EAC, като екзогенни и ендогенни съединения, съдържащи се в обратен хладник. Нитрозо съединенията могат да бъдат приемлива цел за това активиране, като се има предвид тяхната нововъзникваща роля в развитието на BE и EAC. 12-14

За разлика от нашите резултати, предразполагащият ефект на алела NQ01 T върху EAC вече е предложен в малко проучване, включващо 61 случая на EAC, 30 въпреки че последващо по-голямо проучване от същата група не потвърждава тези предишни констатации. 47 Липсата на асоциация в проучването на von Rahden и колеги 47 може да се дължи на факта, че при тяхното разследване случаите на EAC са сравнени със здрави доброволци без рефлукс. Както бе споменато по-горе, защитният ефект на TT генотипа може да се види само в присъствието на прокарциноген, съдържащ се в рефлукс. Поради тези несъответствия ролята на полиморфизма NQ01 в карциногенезата на хранопровода трябва да бъде изяснена при по-нататъшни изследвания. По-специално, би било интересно да се потвърди дали този полиморфизъм влияе върху вероятността от прогресия към BE и EAC в контекста на голямо проспективно проучване, включващо пациенти със симптоми на хроничен рефлукс.

В нашето изследване ние също изследвахме полиморфизъм в гена, кодиращ чистача на свободни радикали MnSOD. Този ензим играе решаваща роля в защитата срещу свободните радикали, като катализира отстраняването на супероксидните радикали до водороден прекис, който след това се превръща във вода чрез каталази и пероксидази. Неотдавнашен доклад показа, че нивата на MnSOD в хранопровода се променят по време на развитието на EAC, 48 потвърждавайки възможната важна защитна роля на този ензим срещу карциногенезата на хранопровода. Изследваният тук полиморфизъм С до Т води до заместване на аланин в позиция 14 на протеина MnSOD с валин, като по този начин променя ефективността на транспортиране на зрелия протеин до правилната субклетъчна локализация. 21, 22 В резултат на това е показано, че този полиморфизъм модулира предразположението към редица злокачествени заболявания, включително рак на гърдата, 23, 24 яйчници, 25 пикочен мехур, 26 и белия дроб 27. Въпреки че експериментите с животни са показали, че приложението на SOD може да намали рефлукс-медиираното увреждане на хранопровода, 6, 7, нашите резултати показват, че генотипът на мястото на MnSOD C14T няма значителен ефект върху риска от усложнения, свързани с рефлукс като BE или EAC. малък ефект, който може да се види при по-големи проучвания.

И езофагитът, и BE са често срещани находки при пациенти със симптоми на рефлукс и се препоръчват за ендоскопия (съответно 37% и 23%). Тъй като и пациентите, и контролите в това проучване са били приети от диспепсия и ендоскопската клиника на Барет, основната сила на нашето проучване е, че всички пациенти са били подложени на ендоскопско изследване, за да се позволи включване в съответната проучвателна група. В резултат обаче нашето проучване е ограничено от относително малкия брой приети пациенти, което означава, че ролята на този полиморфизъм в езофагеалната канцерогенеза трябва да бъде допълнително изяснена в контекста на по-голямо разследване. В допълнение, въпреки че нашите резултати предполагат, че генотипът NQO1 TT може да предпази от прогресия към EAC, неговото развитие като генетичен маркер за идентифициране на пациенти с по-нисък риск от прогресия изглежда невъзможно поради ниската честота на този генотип при лица без заболявания (7,6 % -5,4%).

В заключение, резултатите ни показват, че полиморфизмите NQ01 C609T могат да играят роля в податливостта на пациентите с ГЕРБ към рефлуксни усложнения и че пациентите с Т алели могат да имат по-нисък риск от прогресия към BE и EAC. Необходими са по-големи изследвания, за да се потвърдят тези открития и да се изследва взаимодействието между този генетичен полиморфизъм и специфични експозиции или с полиморфизми в свързани гени.