върху

  • елементи
  • абстрактно
  • Заден план:
  • методи:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Основното
  • Материали и методи
  • Етични аспекти
  • Избор и вземане на проби от пациента
  • Проверка
  • Измерване на изпражненията MMP-9
  • Статистически анализ
  • резултатът
  • Проверка
  • Фекални нива на MMP-9 между групите
  • Фекални нива на MMP-9 по местоположение и етап на CRC
  • дискусия
  • История на промените

елементи

  • Колоректален рак
  • Диагностични марки
  • хидролаза

Тази статия е актуализирана

абстрактно

Заден план:

Колоректалният рак (CRC) е един от водещите злокачествени заболявания в света и евтините, евтини, неинвазивни скринингови методи са много важни. Матричната металопротеиназа-9 (MMP-9) играе роля в прогресията на CRC и нейното ниво е повишено при туморни биопсии. Нивата на фекални MMP-9 са повишени при активни пациенти с улцерозен колит, но никога не са били измервани при пациенти с CRC. Ние се фокусирахме върху определянето на фекалните нива на MMP-9 при пациенти, подложени на обща колоноскопия според ендоскопска и хистологична диагноза.

методи:

Сто и девет пациенти предоставиха фекални проби за анализ на MMP-9. Направена е обща колоноскопия; подозрителните лезии се оценяват по хистология. Фекалните нива на MMP-9 са измерени чрез ELISA.

резултатите:

Броят на пациентите, разделени на различни групи, е: отрицателен/дивертикуларен: 34 (наричан контролен); хиперпластични полипи: 15; аденоми: 32 (22 с висок риск); и CRC: 28. Fecal MMP-9 е значително увеличен в CRC в сравнение с всички други групи (P 400 000 нови случая годишно (Ferlay et al, 2013).) Високата честота на заболяването и фактът, че прогнозата корелира добре с етапът на диагностика прави Колоноскопията е златен стандарт за CRC скрининг поради високата си чувствителност и специфичност, но има и недостатъци като риск от усложнения, високи разходи и по-ниско приемане на пациента като скринингов метод, поради което неинвазивните методи необходими за идентифициране на пациенти с висок риск от CRC.когато е необходимо да се извърши колоноскопия.

Матричните металопротеинази (ММР) са семейство от съдържащи Zn 2+ ендопептидази, секретирани от различни клетъчни типове, като туморни клетки, мезенхимни клетки, фибробласти и възпалителни клетки, като моноцити, лимфоцити и неутрофили. Установена е повишена експресия на MMP-9 в проби от ректален карцином и рак на дебелото черво, където тя корелира с лоша прогноза (Unsal et al., 2008; Araujo et al., 2015; Yang et al., 2014). Наскоро показахме, че фекалните нива на MMP-9 са повишени при пациенти с активен улцерозен колит (UC) в сравнение с пациенти с функционално стомашно-чревно разстройство (синдром на раздразнените черва с преобладаваща диария) или здрави контроли (Annahazi et al, 2013). Установено е, че нивата на фекални MMP-9 са предиктор за активността на заболяването при пациенти с UC (Annahazi et al., 2013) и имат висока специфичност при диагностицирането на поухит (Farkas et al., 2014). Въпреки това, фекалните нива на MMP-9 при пациенти с CRC не са проучени.

Въз основа на това, ние се фокусирахме върху измерването на фекалните нива на MMP-9 при пациенти, подложени на колоноскопско изследване в нашата болница, и върху анализа на резултатите според различни колоноскопски и хистологични находки.

Материали и методи

Етични аспекти

Протоколът за изследване е одобрен от Комитета по етика на Сегедския университет в Сегед, Унгария. Всички субекти предоставиха писмено и информирано съгласие за участие.

Избор и вземане на проби от пациента

Общо 109 пациенти (мъже/жени: 58/51, възраст: 29-91 години, средно: 66,0 години) бяха включени в нашето проучване, които бяха включени в нашето специализирано колоректално звено в първото медицинско отделение в Сегед, Унгария, които са претърпели колоноскопия за всички. Нито един пациент не е имал анамнеза за UC или анамнеза за други видове рак. Един пациент, за когото по-късно е установено, че има ректален аденокарцином, е имал метастази в черния дроб. Проби от изпражнения се събират от всички пациенти 2 до 4 дни преди колоноскопията и се замразяват при -20 ° C в рамките на 1 час след дефекацията. Всички колоноскопии бяха завършени до достигане на терминалния илеум. По време на колоноскопията са взети биопсии от всички предполагаеми лезии и е извършена хистология. Въз основа на колоноскопски и хистологични резултати, пациентите са разделени на пет групи: отрицателни, дивертикулоза, хиперпластичен полип, аденом и CRC. Счита се, че аденомите са изложени на повишен риск от злокачествено заболяване, когато е изпълнено едно от следните условия: размер на полипа> 10 mm; вилозен аденом или тубуловилозен аденом с най-малко 20% компонент на вили; висококачествена дисплазия; или множествен аденом (> 3).

Проверка

Нашата група беше първата, която използва търговски имуноанализ за човешки количествени ензими от R&D Systems (Abingdon, UK, Cat. No. DMP900) за измерване на нивата на MMP-9 в изпражненията. Затова проведохме тест за валидиране, за да тестваме дали самата фекална матрица влияе върху определянето на MMP-9 и дали комплектът от R&D Systems е в състояние да определи MMP-9 от екстракти от човешки фекалии.

Към екстракционната среда беше добавен активен човешки пълен протеин MMP-9 (Abcam LTD, Кеймбридж, Великобритания; кат. №: ab157344; ЛОТ №: GR218764-1). Контролните проби от фекалии се претеглят и 1 ml екстракционна среда с или без добавяне на MMP-9 се прилага 0,25 mg проба (съотношението на пробата към екстракционната среда е 1: 4). Пробите незабавно се хомогенизират за 2 х 30 s и се инкубират в продължение на 10 минути при стайна температура. Впоследствие всички хомогенати се центрофугират при 1500 ж в продължение на 10 минути, последвано от второ центрофугиране на супернатантите от първия етап на центрофугиране при 10 000 ж за 10 минути. Крайните супернатанти бяха обработени за тест за линейност (паралелизъм). Екстрактът, съдържащ добавения MMP-9, се разрежда последователно 1 + 1, за да се получат 50, 25, 12, 5 и 6, 25% от първоначалното съдържание на MMP-9 с екстракт от същите изпражнения, които не съдържат добавени MMP- 9. След това всички проби, включително 100% добавен екстракт от ММР-9 и естествен контролен екстракт без добавяне на ММР-9, бяха подложени на измерване на ММР-9, използвайки гореспоменатия ELISA комплект за човешки ММР-9. Комплектът е способен да открива човешкия 92 kDa Pro-MMP-9 и 82 kDa активната форма на MMP-9, както е описано от производителя. Добавеният MMP-9 протеин, получен за тази оценка, е 92 kDa Pro-MMP-9.

Измерване на изпражненията MMP-9

Пробите се съхраняват при -20 ° С за максимум 3 месеца и след това се оставят да се стопят при 4 ° С за 1 ден. Общо 1,0 g от всяка фекална проба се разреждат, смесват и хомогенизират в 4 ml ледено студен Tris-буфер (0,15 M NaCl + 20 m M Tris-HCI, рН: 8,3). След центрофугиране (10 минути, 4500 об/мин, 4 ° С), пелетите се отстраняват и супернатантите наскоро се центрофугират (10 минути, 10 000 g; 4 ° С). Крайните супернатанти се филтрират с 0,8 μm спринцовъчни филтри с размер на порите и аликвотни части се съхраняват при -20 ° С до анализ. MMP-9 се измерва чрез количествения ензимно-свързан имуносорбентен анализ, описан по-горе.

Статистически анализ

Непрекъснатите данни бяха представени като средно ± sd от теста на Kruskal-Wallis, който беше използван за сравняване на фекалните нива на MMP-9 от различни групи (контрол, хиперпластичен полип, аденом и CRC). Нивата на MMP-9 от подгрупите с висок и нисък риск от аденом бяха анализирани с помощта на теста на Ман-Уитни. Различните подгрупи според местоположението на тумора или стадия са сравнени с теста на Kruskal-Wallis. Разликите се считат за статистически значими, когато P 0, 8 (Baker and Kramer, 2007). Граничната стойност се определя от максималната стойност на индекса Youden (чувствителност + специфичност - 1). Статистическите анализи бяха извършени с помощта на статистически софтуер R (версия 3.1.2) (//www.r-project.org/).

резултатът

Проверка

Концентрациите, измерени в ng ml -1, са показани на фигура 1. Фигурата ясно показва линейната промяна в концентрацията, съответстваща на разреждането. Тоест, (i) фекалната матрица сама по себе си няма ефект върху определянето на MMP-9; и (ii) комплектът от R&D Systems е в състояние да определи MMP-9 от екстракти от човешки фекалии.

Нива на концентрация на MMP-9 при различни разреждания в теста за валидиране.

Изображение в пълен размер

Фекални нива на MMP-9 между групите

Фекални нива на MMP-9 от различни групи (въз основа на колоноскопия и хистология). Съкращение: CRC = колоректален рак.

Изображение в пълен размер

ROC CRC спрямо контролна крива.

Изображение в пълен размер

Фекални нива на MMP-9 в аденони.

Изображение в пълен размер

Фекални нива на MMP-9 по местоположение и етап на CRC

Броят на пациентите за мястото на CRC е както следва: ректум: 14, сигмоидно дебело черво: 6, линейна флексия: 1, напречно дебело черво: 2, чернодробна флексия: 2, възходящо дебело черво: 1 и коекум: 2 пациенти. Когато фекалните нива на MMP-9 се анализират чрез CRC сайт, не се наблюдава значителна разлика (P = 0, 146), въпреки че при ректални тумори се наблюдава тенденция към по-високи нива (средно: 12, 33 ± 7, 274 ng ml - 1) в сравнение с лявото дебело черво (двоеточие-флексо-сигмоидно дебело черво; средно: 1,619 ± 0,978 ng ml -1) и напречно дясно дебело черво (от кокума до напречно дебело черво; средно: 1,830 ± 0,656 ng ml -1; 5А). Според класификацията на Dukes не се наблюдава значителна разлика между групите (Фигура 5B; P = 0,236).

Нива на изпражнения MMP-9 при пациенти с CRC. Стойности от ( A ) местоположение и ( Б. ) Дукес етапи на CRC.

Изображение в пълен размер

дискусия

Доколкото ни е известно, за първи път докладваме, че нивата на MMP-9 са повишени в пробите на изпражненията от пациенти с CRC в сравнение с пациенти без полипозни лезии. В допълнение, фекалният MMP-9 може да се използва за разграничаване на пациенти с CRC от пациенти без полипоидни лезии с висока чувствителност и специфичност. В допълнение, фекалният ММР-9 е в състояние да идентифицира почти 60% от пациентите с високорисков аденом с по-ниско гранично ниво.

Не открихме значителна разлика между фекалните нива на MMP-9 в групи с различни локализации на тумора. Въпреки това, при пациенти с ректален аденокарцином може да се наблюдава тенденция към най-високите нива на MMP-9 във фекалиите. Това вероятно не е свързано с естеството на ректалните тумори, но може да се обясни с по-краткото време на деградация на маркера в интуменния лумен, подобно на FIT (Morikawa et al., 2005).

Независимо от това, нашето проучване беше подходящо за идентифициране на нов маркер, изпражнения MMP-9, който е в състояние да различи CRC от контролите без полипи. Fecal MMP-9 се характеризира с много предимства на FIT, както и с молекулярни маркери без високи разходи. Необходими са допълнителни проучвания върху по-голяма и по-обща популация, за да се потвърди дали този обещаващ метод е подходящ за скрининг на CRC като допълнителен тест.

История на промените

Това произведение се публикува въз основа на стандартен лиценз за публикуване на договор. След 12 месеца произведението става свободно достъпно и лицензионните условия преминават към непубличен лиценз Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 4.0.