вентралната

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • Материали и методи
  • звяр
  • Интра-VTA инжекция
  • Прием на храна
  • Локомоторна активност
  • Оперативен отзивчив
  • електрофизиология
  • Флуоресцентно сортиране на клетките
  • Количествена PCR
  • грундове
  • Внедряване на FA в DA неврони
  • Статистически анализи
  • резултатът
  • Интра-VTA олеатът инхибира приема на храна и стимулира двигателната активност
  • Oleate In-VTA потиска храната
  • Олеат модулира DA невроналната активност
  • Протеини DA Neurons Express FA-Handling Proteins
  • FA се поемат от DA Neurons
  • дискусия
  • заключение
  • Финансиране и оповестяване
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация

елементи

  • Клетъчна сигнализация
  • Мастни киселини
  • Поведение при хранене
  • неврофизиология
  • Награда

абстрактно

Дълговерижните мастни киселини (FA) са метаболитни сигнали, които се откриват централно за регулиране на енергийната хомеостаза. Първоначалната работа установи, че хипоталамусните неврони променят скоростта на изстрелване в отговор на FA (Oomura et al., 1975), докато скорошни проучвания показват ефекта на централно администриран FA върху потискането на чернодробното хранене и производството на глюкоза (Lam et al., 2005; Obici et al., 2005;, 2002; Schwinkendorf et al., 2011). Съобщава се, че способността на FA да инхибира приема на храна и да модулира автономната функция и невротрансмисията се медиира от клетъчния транспорт на FA и вътреклетъчния метаболизъм (Lam et al., 2005; Le Foll et al., 2013; Moulle et al., 2013; Obici et al., 2003). Доказано е, че блокирането на хидролизата на FA от триацилглицерол в мозъка повишава апетита и наддаването на тегло (Cansell et al., 2014; Picard et al., 2014b).

Има някои доказателства, които предполагат, че ефектът на FA върху енергийния метаболизъм зависи от химическата структура на FA веригата. Мононенаситеният FA олеат (OA) и наситеният FA палмитат (PA) са най-разпространените FA вериги с дълги вериги в циркулацията и могат да упражняват различни сигнални и метаболитни ефекти в мозъка. Доказано е, че OA, най-разпространеният FA в природата, намалява приема на храна, когато се прилага остро в третата камера (Obici et al., 2002; Schwinkendorf et al., 2011) и инхибира или възбужда хипоталамусните неврони (Jo et al., 2009; Le Foll et al., 2009; Wang et al., 2006). В допълнение, ние показахме, че OA има отчетлива вътреклетъчна метаболитна съдба в нервните клетки в сравнение с PA (Taib et al, 2013).

Материали и методи

Експериментите бяха одобрени от Комитета по хуманно отношение към животните на CRCHUM, Комитета по етика на животните към Университета на Монреал и Комитета по институционални грижи и употреба на животните в Медицинското училище в Ню Джърси. Всички поведенчески тестове бяха проведени върху плъхове, за да се поддържат точни VTA микроинжекции, докато останалите експерименти бяха проведени върху мишки поради наличието на трансгенни линии и методи, установени за първични DA невронни култури. Мъжки плъхове Wistar (Charles River, Saint-Constant, Quebec) с тегло 250-280 g при пристигане бяха настанени 8-10 дни преди операцията в стаите за обратен цикъл (светлините се изключват от 1000 часа). Мъжки мишки C57B1/6 (на възраст 4-6 седмици) бяха използвани за електрофизиологични записи. TH-eGFP трансгенни мишки (фон C57B1/6), експресиращи зелен флуоресцентен протеин (GFP) под контрола на промотора на тирозин хидроксилаза (TH) (Matsushita et al., 2002) бяха използвани за флуоресцентно сортирано клетъчно сортиране (FACS). Първичните DA невронални култури са получени от постнатални (P0 - P2) мишки C57B1/6 (Fasano et al, 2008).

Интра-VTA инжекция

Стереотаксичната хирургия се извършва под изофлуранова анестезия и се ръководи от координатите на атласите на плъхове на плъхове (Paxinos and Watson, 1998). Плъховете са имплантирани с двустранна направляваща канюла (габарит 26, Plastics One), завършваща на 2 mm над VTA (5,8 mm зад брегмата, ± 0,6 mm от средната линия и -6 mm от твърдата мозъчна обвивка). OA и PA (Na +; Sigma-Aldrich) бяха комплексирани с хидроксипропил-β-циклодекстрин (HPB, CTD Holdings, Alachua, FL, USA) и разтворени в изкуствена цереброспинална течност (aCSF, в mM: 125 NaCl, 2.5, 5 KCl, 0,3 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 10 глюкоза, 1,3 MgS04 и 2,4 CaCl2; рН 7,4) до крайно количество от 6 nmol на страна. Дозата от 6 nmol представлява 1/5 от дозата, използвана в предишни проучвания за оценка на храненето в отговор на OA и PA на третата камера в комплекс с HPB (30 nmol - Obici et al., 2002; Schwinkendorf et al., 2011). Тъй като открихме значителен аноректичен отговор на 60 nmol, но не и на 30 nmol, OA инфузии в страничната камера (данните не са показани), използвахме 10: 1 разреждане на паренхима в камерата, за да достигнем доза от 6 nmol интра-VTA. Флоретин (EMD Millipore) се разтваря в 15% етанол и се разрежда до 100 цМ в ​​aCSF. Веществата се доставят в обем от 500 nl на страна със скорост 100 nl/min, като се използва двустранна вътрешна канюла (Plastics One), която излиза на 2 mm зад водещата канюла.

Прием на храна

Бяха използвани две кохорти плъхове (общо n = 41) за оценка на ефекта на интра-VTA OA и PA върху приема на храна. Плъховете бяха свикнали на прахообразна диета с храна в продължение на 4-7 дни. Храната беше отстранена 3 часа преди инжектирането на OA или носител или PA или носител, което се случи непосредствено преди началото на тъмния цикъл. Хранителните контейнери, пълни с прахообразна храна, бяха монтирани в по-голям контейнер за улавяне на разливи. Консумацията на храна и телесното тегло се наблюдават 2, 6, 12 и 21 часа след инжектирането.

Локомоторна активност

Амбулаторната активност се оценява в метаболитни камери (AccuScan Instruments, Columbus, OH, USA), в които плъховете са привикнали 24 часа преди инжектирането на FA. Инжекциите са направени непосредствено преди началото на тъмната фаза.

Оперативен отзивчив

Друга група плъхове (n = 10) с двустранни VTA канюли бяха обучени да реагират на 45 mg пелети с високо съдържание на мазнини и висока захароза захароза (TestDiet, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) за прогресивно съотношение на усилване в плъхове с операционни камери с повдигащи лостове (Med Associates, St. Albans, VT, USA), както е описано по-рано (Sharma et al., 2012). След като се постигне стабилен отговор на прекратяването, се оценяват ефектите от инжектирането в интра-VTA носителя, последвано от инжектиране на ОА на следващия ден. След стабилизиране на разрушаването (стабилността на броя на получените добиви не се е променила с повече от 15%), беше оценен отговорът на оператора при същите животни в отговор на носител и след това съвместно инжектиране на OA + флоретин (100 μM в 0,5% етанол ). Тестването на поведението започна 1 час след инжектирането в началото на тъмната фаза. Местоположението на канюлата се проверява чрез инжектиране на метиленово синьо (500 nl на страна) след завършване на експеримента.

електрофизиология

Флуоресцентно сортиране на клетките

P0-P2 мишки бяха криоанестезирани и обезглавени за събиране на тъкани. Както беше описано по-рано (Fulton et al., 2011; Mendez et al., 2008), прясно дисоциираните клетки бяха получени от VTA и GFP-положителни неврони бяха пречистени чрез FACS и директно събрани в Trizole (Qiagen, Toronto, ON, Canada).

Количествена PCR

Общата РНК от микродисекции на VTA и вентромедиален хипоталамус (VMH) и сортирани по FACS клетки се екстрахира с Trizol. Концентрацията и чистотата на РНК се оценяват систематично. РНК се транскрибират обратно в кДНК, като се използва обратна транскриптаза на вируса на миша левкемия на Moloney (M-MLV RT, Life Technologies, Burlington, ON, USA). Гените се амплифицират, като се използва Rotor-Gene SYBR Green PCR PCR комплект (Qiagen) в присъствието на подходящи праймерни двойки. Резултатите бяха нормализирани до β-актин или циклофилин и анализирани с помощта на стандартен метод на кривата (Taib et al, 2013).

грундове

Праймерите са проектирани с помощта на BLAST (Национална медицинска библиотека на САЩ) и са синтезирани от Интегрирани ДНК Технологии въз основа на следните последователности: actb (β-актин) напред: 5-′TTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGCA-3 ', обратен: 5'-ACCAGACAGCACTGTGTTGGCATA-3'; cd36 напред: 5'-TGCATGAATTAGTTGAACCAGGCCA-3 ', обръщане: CCACAGTTCCGATCGCAGCC-3', ppia (циклофилин) напред: 5'-GCTTTTCGCCGCTTGCTGCA-3 ', обръщане: TGCAAACCAGCA fabp3 напред: 5'-GATGACCGGAAGGTCAAGTC-3 ', обратен: 5'-GCCATGAGTGAGAGTCTCGAGA-3'; fabp5 напред: 5'-AAACCGAGAGCACAGTGAAGA-3 ', обратен: 5'-AAGGTGCAGACCGTCTCAGT-3'; fabp7 напред: 5'-AGTACATGAAGGCTCTGGGCGTG-3 ', обратен: 5'-ATCACCACTTTGCCGCCTTCCT-3'; fatp1 напред: 5'-GCAGGTACTACCGCATTGCT-3 ', назад: 5'-GAACTTCTTGCGCAGTACCA-3'; fatp4 напред: 5'-TGTGGTGCACAGCAGGTATT-3 ', назад: 5'-TTTCCTGCTGAGTGGTAGAGG-3'; gad1 (GAD67) напред: 5'-ATATCATTGGTTTAGCTGGTGAATG-3 ', назад: 5'-GTGACTGTGTTCTGAGGTGAAGAG-3'; напред: 5'-CGACCCGTGGCCGGTCTAC-3 ', назад: 5'-GCAGTCTGGCTCGGGTGAGTG-3'.

Внедряване на FA в DA неврони

DA невроните на средния мозък, отглеждани върху кортикалния глиален слой, са получени от мишки P0-P2 от див тип, както е описано (Fasano et al, 2008). Поглъщането на FA се оценява с помощта на C1-BODIPY 500/510-C12, флуоресцентен аналог на FA, който наподобява химическата структура на FA с дълга верига с флуорофорна глава (20 μM в 0,8% DMSO; ThermoFisher). Десет дни след инокулацията клетките се третират с BODIPY, BODIPY + флоретин (100 μM в 0,5% етанол) или самостоятелно носител в хранителна среда (Neurobasal, допълнен с глутамакс) в продължение на 45 минути. След три измивания с ледено студен PBS, клетките се фиксират с 10% формалин в продължение на 10 минути. TH имунофлуоресценцията се извършва, както е описано по-рано (Fulton et al., 2011). Аналитичният инструмент ImageJ (//imagej.nih.gov/ij/) е използван за определяне на интензивността на флуоресценцията на BODIPY. За всяко условие интегрираната плътност беше измерена в × 63 увеличени полета (n = 45), получени от три отделни покривни стъкла за условие.

Статистически анализи

Данните са представени като средно ± SEM и са анализирани с помощта на GraphPad Prism (версия 5.02 за Windows GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Двупосочен вариационен анализ (ANOVA) с пост-тестове на Bonferonni е използван за анализ на данни за приема на храна и двигателна активност. Еднопосочен ANOVA се използва в електрофизиологията и имунофлуоресценцията с Bonferonni пост-анализи. Данните, отговарящи на оператора, и количествената PCR (qPCR) са анализирани чрез t-тест на Student. Статистическата значимост е определена на p = 0,05.

резултатът

Интра-VTA олеатът инхибира приема на храна и стимулира двигателната активност

Тествахме острите ефекти на интра-VTA OA и PA върху приема на храна. Както е показано на фигури 1а и b, OA значително инхибира приема на храна 12 часа след инжектирането (носител: 23,9 ± 1,3 g, OA: 19,6 ± 1,6 g; намаление с 18%; повторни измервания двупосочно ANOVA; F 1, 21 = 4, 47, р 0,05) или движение (F 1, 16 = 0,07, р> 0,05; Фигура 1в и г). Двустранните координати на VTA канюлата бяха потвърдени чрез инжекции на микросфери от родамин (Допълнителна фигура S1A). Аноректичните ефекти на OA или PA не са свързани с локално възпаление, тъй като нивата на mRNA на IL-1 и TNFα в VTA не се променят след инжектиране на OA (OA: IL-1 p: t17 = 0,29; TNFα: t17 = 0,35 PA: IL - lp: t4 = 0,84, TNFα: t4 = 1,25, p> 0,05, допълнително изображение S1B и C).

Интра-VTA олеатът инхибира приема на храна и стимулира двигателната активност. a, b) Двустранното микроинжектиране на OA (6 nmol/страна) намалява приема на храна (a) и повишава локомоторната активност (b). (c, d) Инжектирането на PA в VTA при еквивалентна концентрация няма ефект върху приема на храна (c) и движението (d). n = 8–13/група за оценка на приема на храна; n = 7–10/група за експеримента за физическа активност. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. Двойно повтарящи се мерки ANOVA, * p 0, 05) или реагиращи пелети с високо съдържание на мазнини/захар (допълнителна фигура S3); t5 = 1,05, р> 0,05). Това обаче предотврати реакцията на атенюираната точка на прекъсване, индуцирана от OA (t6 = 0,31, p> 0,05; Фигура 2b). Не се наблюдават промени в съотношението между правилните и неправилните депресии на лоста (OA: t7 = 0,27; OA + флоретин: t6 = 0,66, p> 0,05; Фигура 2в и d). Последваща хистологична оценка разкрива, че двустранни канюли са били поставени във VTA при всички плъхове (Фигура 2д).

Олеатът притъпява полезните ефекти на храни с високо съдържание на мазнини и захар. а) Интра-VTA инжектирането на OA намалява точката на прекъсване, която реагира на пелети с високо съдържание на мазнини/захароза в хирургическа задача с прогресивно съотношение б) Съвместното инжектиране на блокер на транспортера на блокера на телоретин предотвратява ефекта на ОА. (c, d) Нито едното лечение не е повлияло процента на правилните реакции на лоста. д) поставяне на инжекционната канюла; всеки символ представлява различен плъх (n = 7). Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. * p 0, 05).

Олеатът модулира допаминовата невронална активност. а) Записи на спонтанна електрическа активност на VTA DA неврони от клетъчни токови терминали. OA намалява честотата на потенциал на действие (APF) на повечето регистрирани DA неврони. Едновременното приложение на флоретин предотвратява индуцираното от ОА инхибиране на APF. n = 6. б) Представителен запис. Потенциалът на стайната мембрана е обозначен с хоризонтална пунктирана линия и е показан вляво. (c, d) Записи на напрежение, показващи, че OA намалява амплитудата (I mEPSC, c) и честотата (d) на миниатюрни възбуждащи постсинаптични токове в инхибираните от OA неврони, ефект, който предотвратява флоретин. n = 7. д) Представителни следи. Деформациите надолу представляват mEPSC. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. Еднопосочни стандартни (а) или повтарящи се мерки (в, г). * p # p ### стр

Профил на генна експресия на мазнини, манипулиращи протеини в допаминовите неврони и VTA. DA невроните (GFP +) и не-DA клетките (GFP-) бяха сортирани чрез FACS от TH-eGFP мишки. GFP + невроните са допаминергични, както се доказва от високи нива на TH mRNA и липсата на GAD67 mRNA. Циклофилинът служи като референтен ген и всички резултати (с изключение на TH и GAD67) се нормализират до стойности, получени от VMH тъкан. FABP, протеин, свързващ мастни киселини; FATP, протеин за транспортиране на мастни киселини; GAD67, глутамат декарбоксилаза; TH, тирозин хидроксилаза.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

FA се поемат от DA Neurons

Вътреклетъчният FA транспорт се оценява с помощта на BODIPY, дълговерижен флуоресцентен аналог на FA. Прилагането на BODIPY върху първични DA неврони води до точково маркиране в TH (TH +) имуноположителни неврони, както и маркиране в не-TH клетки (Фигура 5д, увеличена след 5 часа). Оптичното Z-изображение и ортогоналната реконструкция разкриват клетъчно маркиране на сферична форма, наподобяваща липидни капчици в TH + клетки и процеси (Фигура 5е и f). Размерът на включването на BODIPY беше намален чрез добавяне на флоретин към инкубационната среда (Фигура 5f и g). Приложението на BODIPY значително повишава интензивността на клетъчната флуоресценция (изразена като интегрирана стойност на плътността) в сравнение със състоянието на носителя, докато едновременното приложение на флоретин отслабва интензивността на маркирането на флуоресценция в TH + неврони (F 2, 44 = 502, 0, p = 0, 0001; 5j).,

Прием на мастни киселини в първичните допаминови неврони. Прилагането на дълговерижния FA BODIPY аналог към хранителната среда води до вътреклетъчна пунктуация (зелено) в цитоплазмата, както и DA процеси на неврони, идентифицирани чрез TH имунофлуоресценция (червено). (a, d, g) Използване на превозното средство. b, e, h) приложение на BODIPY (20 μM). (c, f, i) Нанасяне на BODIPY (20 μM) + флоретин (100 μM). й) Стойности на интензивността на флуоресценция на BODIPY при условия на лечение. Три слайда за едно покритие. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. Еднопосочна ANOVA. *** p ### p