дендритни

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • RA сигнализирането в DC контролира развитието на чревен cDC
  • RA насочва създаването инвитро чревни cDC1 и cDC2 подгрупи
  • RA контролира преписи инвитро получени cDC1 и cDC2 към физиологични модели на генна експресия.
  • RA контролира експресията на транскрипционни фактори, участващи в диференциацията на cDC
  • Прекомерно представяне на места за свързване на NF-κB/REL в генно потиснати генни промотори
  • дискусия
  • методи
  • стъпки
  • Gene express Omnibus
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителни легенди за изображения
  • Файлове с изображения
  • Допълнително изображение S1
  • Допълнително изображение S2
  • Допълнително изображение S3

елементи

  • Клетъчна сигнализация
  • Дендритни клетки
  • Имунология на лигавицата
  • препис

абстрактно

Червата са постоянно изложени на микробиотици, усвоена храна и нахлуващи патогени. Чревните дендритни клетки (DC) играят ключова роля в имунната хомеостаза, като насочват имунните реакции, подходящи за всеки наличен антиген и стимул. DC имат уникалната способност да вземат проби и да обработват антигени и да транслират микроекологични сигнали за Т и В клетки чрез представяне на цитокини и метаболити, за да предизвикат и регулират имунните реакции или да предизвикат или поддържат толерантност.

Двете преобладаващи подгрупи на конвенционални дендритни клетки (cDC) в тънките черва (SI) са фенотипично идентифицирани като CD11c + MHCII + клетки, които са или CD103 + CD11b - (cDC1) или CD103 + CD11b + (cDC2). Подмножествата се различават в развитието и изискват различни транскрипционни фактори. Въпреки че и двата процеса обработват локален антиген, мигрират към дрениращи мезентериални лимфни възли (MLN), произвеждат толерогенни или имуностимулиращи отговори и изтласкват Т-клетките в червата, те също се различават функционално: напр. CDC2s експресират TLR5, който разпознава флагелина и са по-добри индуктори. Th17 клетките и IgA и cDC1 синтезите експресират TLR3, примерен рецептор за двуверижна вирусна РНК, и показват Clec9A и XCR1, рецептори, замесени в специализираната способност на cDC1 да кръстосано присъства асоциирани с клетки антигени към CD8 Т клетки in vivo. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 И двете подгрупи могат да бъдат получени от фенотипично различни прекурсори на костен мозък (BM), 10, 11, включително DC преди лигавицата (pre-μDC), чревен предшественик, който може да доведе до cDC подгрупи, както и до плазмацитоиден DC. Pre-μDC експресира чревния направляващ рецептор α4β7, мигрира за предпочитане в чревната ламина propria (LP) и ефективно репопулира чревните запаси на cDC.

Тук се опитахме да определим дали RA също води до по-нататъшното развитие на pre-μDC и да изследваме приноса му към специализацията на чревните подгрупи на cDC. Нашите резултати показват, че вътреклетъчното RARα сигнализиране регулира чревната продукция на cDC преди μDCs и играе централна роля както в cDC1, така и в cDC2 транскрипционно програмиране. По-нататък показваме, че в комбинация с гранулоцит-макрофагов колониестимулиращ фактор (GM-CSF) и Flt3L, RA насочва ефективно in vitro производство на cDC с уникалните характеристики на чревните cDC1 и cDC2 от техните чревни предшественици pre-μDC.

резултатът

RA сигнализирането в DC контролира развитието на чревен cDC

Първоначално оценихме cDC при мишки с дефицит на витамин А (VAD), хранени с VAD диета в продължение на 12 седмици след матката. 17 VAD засяга както фенотиповете, така и представянето на чревните cDC подгрупи. Честотата и броят на cDC2 (CD103 + CD11b +) бяха намалени както в SI LP, така и в мезентериалните лимфни възли на мишки C57BL/6, в сравнение с мишки на контролна диета (Фигура 1а, b). Подобни резултати бяха получени при мишки BALB/c (допълнително изображение Sla онлайн) и при мишки C57BL/6, хранени с VAD диета, започвайки след отбиването (допълнително изображение S1b). За разлика от подмножествата CD103 + cDC, смесената популация CD103 - CD11b +, която се състои от макрофаги и по-малки CD103 чревни популации cDC, въпреки че се различава по брой и честота в нашите проучвания, не показва постоянна разлика между контролните и VAD мишките ( данните не са показани). Критичната оценка на въздействието на RA върху развитието на макрофагите ще изисква изследвания с други маркери на макрофагите.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

RA засяга множество видове клетки в червата, включително стромални клетки и епител, и може косвено да повлияе на cDC. За да определим дали това е присъщо за DC RAR сигнализиране, ние проектирахме мишки, за да експресират доминиращ отрицателен RARα, RAR403, под контрола на CD11c промотора чрез кръстосване на мишки CD11c-Cre с мишки, носещи RAR403 надолу по веригата на lox P-фланкираната STOP касета. . (dn Rara lsl/lsl). 29 Тези „мишки DC-RAR403“ са имали значително намаляване на абсолютния брой на cDC2 и съотношението cDC2/cDC1 в SI LP и мезентериалните лимфни възли в сравнение с техните дичи от див тип (WT) (Фигура 2а) и тези ефекти са били по-изразени в мишки, които са имали две копия на гена RAR403 (DC-RAR403 fl/fl) в сравнение с мишки с едно копие (DC-RAR403 fl/-). Както при VAD мишките, субпопулация на чревни cDC1 клетки в DC-RAR403 мишки експресира CD207 (Langerin) (Фигура 2b). Резултатите предполагат, че RA действа вътрешно върху клетките в чревния cDC1 и cDC2, като по този начин влияе върху техния фенотип и развитие. Съобщава се обаче, че подгрупите на чревни макрофаги показват рекомбинация на cre при 30 CD11c-cre мишки и могат да експресират RAR403 в нашия модел; следователно не могат да бъдат изключени косвени ефекти на макрофагите върху cDC фенотипите.

Ефекти на дендритните клетки (DC) - ограничена липса на сигнали за ретиноева киселина (RA) върху DC (SI) на тънките черва. а ) Съотношение на cDC2 към cDC1 в SI lamina propria (LP) и MLN и брой на cDC2 в SI LP на DC-RAR403 -/- (стандартен тип (WT)), DC-RAR403 fl/- (хетерозиготен) и DC - RAR403 fl/fl (хомозиготни) мишки. ( б ) отклонена експресия на CD207 върху SI cDC1 от мишки DC-RAR403. Представителни графики, илюстриращи CD207 експресионни клетки, използващи SI cDC1 от DC-RAR fl/fl мишки (клетките в портата CD207 + са показани като големи точки за илюстрация). Графиката на разсейване показва процента на cDC1 в SI, който изразява CD207. Несдвоено едностранно t-тест. cDC, конвенционална дендритна клетка; MLN, мезентериални лимфни възли.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

CDC на слезката също е засегнат при мишки DC-RAR403 (допълнителна фигура S2). Както при DC на мишки DC-RAR403, подмножество CD8a + cDC1 на далак в мишки DC-RAR403, но не и в WT контроли, изрази Langerin (CD207) (Допълнителна фигура S2a). И двата CD11b + и CD8a + cDC номера бяха намалени в далака на DC-RAR403 мишки, но съотношението на CD11b + cDC към CD8a + cDC не се промени в сравнение с WT хвърлящите (допълнителна фигура S2b и данните не са показани). Въпреки това, cDC, експресиращ Clec4a4 (DCIR2, разпознат от Mab 33D1, класически cDC2 маркер) е значително намален, което води до намаляване на съотношението на cDC2 към cDC8a + cDC1, определено от Clec4a4 (допълнителна фигура S2c). Подгрупата Clec4a4 +, която е силно намалена по брой при мишки DC-RAR403, също експресира Esam при WT мишки (допълнителна фигура S2d). По този начин клетъчната присъща RAR сигнализация засяга както cDC1, така и cDC2 в далака, както и в SI.

Заедно резултатите показват, че DC-присъщата RAR сигнализация регулира развитието и фенотипната специализация на cDC подгрупи както на чревни, така и на екстраинтестинални сайтове, но подкрепя особено важна роля на RA при определяне на чревните cDC фенотипи и регионална специализация при проксимални SI и мезентериални лимфни клетки дренаж. възли, където концентрациите на RA са високи.

RA насочва in vitro образуването на чревни cDC1 и cDC2 подгрупи

Ретиноевата киселина (RA) контролира образуването на интендинални подгрупи на DC-подобни дендрактични клетки (DC) in vitro. ( а - ° С ) Пред-лигавичните DC (pre-μDC) бяха сортирани от BM мишки, инжектирани с Flt3L и култивирани в пълна модифицирана среда на Deulbecco на Iscove с 10% делипидиран серум, допълнен с Flt3L и гранулоцит-макрофагичен колония стимулиращ фактор (GM) -CSF) 100 nM RA (или AM580 in ° С ), освен ако не е посочено друго. Културите се събират на ден 4 и се анализират чрез поточна цитометрия. а ) Показани са повърхностни маркери и активност на ретиналдехид дехидрогеназата (RALDH), показана чрез оцветяване с AldeFluor върху чревни и получени in vitro cDC1 (пунктирана линия) и cDC2 (плътна линия). Представител на поне три независими експеримента. ( б ) Експресия на Clec9a върху in vitro произведени cDC1 и CD101 върху cDC2 с различни концентрации на RA. Представител на два независими експеримента. ( ° С ) Посочени са съотношението на cDC2 към cDC1, броят на клетките от общото потомство и броят на cDC1 и cDC2 в култури, третирани с посочените концентрации на RA или AM580. Данните се събират от три независими експеримента. cDC, конвенционална дендритна клетка.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Добавянето на RA обаче доведе до образуването на cDC1 и cDC2 с ключови фенотипни характеристики на две чревни cDC подгрупи, включително TLR3 на cDC1 и CD101 на cDC2, както и експресията на ретиналдехид дехидрогеназа от двете подгрупи (Фигура 3а). Тези резултати предполагат, че GM-CSF, Flt3L и RA работят заедно, за да осигурят критичните сигнали, необходими за разграничаване на чревните cDC от предшествениците на BM. RA регулирането на Clec9a за cDC1 и CD101 експресия в cDC2 подгрупата зависи от дозата (Фигура 3b).

RA причинява увеличение на cDC2 in vitro, подобно на ефекта му in vivo. Когато pre-μDCs бяха култивирани с различни концентрации на RA или RARα агонист AM580 в продължение на 4 дни, присъствието на RA или AM580 увеличи броя на генерираните cDC2, като същевременно намалява броя на cDC1, ефективно увеличавайки съотношението cDC2/cDC1. Ефектът на RA е зависим от дозата, като съотношението cDC2/cDC1 се увеличава от 0 до 1 nM RA и платото се увеличава, когато концентрацията на RA достигне нивото, отчетено за SI 25 (

10 nM). Тъй като общият брой на потомствените клетки не е бил засегнат от RA или AM580 (Фигура 3в), резултатите са в съответствие с директното действие на RA върху RARα в DC предшественици, за да повлияе на тяхната съдба.

Заедно резултатите предполагат критична присъща роля на RA при чревната специализация на cDC и определят културни условия за моделиране на развитието на cDC в червата.

RA насочва in vitro транскриптите на cDC1 и cDC2, получени към физиологични модели на генна експресия.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint
  • Изтеглете слайд на PowerPoint

RA контролира експресията на транскрипционни фактори, участващи в диференциацията на cDC

Прекомерно представяне на места за свързване на NF-κB/REL в генно потиснати генни промотори

RA обикновено активира генната експресия, но лечението с RA потиска експресията на много гени, индуцирани или експресирани в нашия културен модел. Използвахме Enrichr 38 за идентифициране на свръхпредставени мотиви за свързване на транскрипционен фактор в промоторните области на гени, които бяха два пъти по-ниски в RA-третирани клетки, отколкото в контролните cDC1 клетки: най-високи резултати бяха ядреният фактор-kB (NF-kB) и REL TFBS ( TRANSFAC) и pwm модул JASPAR, P ≤ 10 −20 и −12 (виж по-долу)). RA регулирани надолу гени в cDC1 също са значително обогатени за гени, участващи в NF-κB-медиирани провъзпалителни сигнални пътища (Wikipathways, P = 0, 00004). NF-κB мотивите също бяха обогатени за промотори на RA-репресирани (двойни или повече) гени в диференциране cDC2 (TRANSFAC и JASPAR pwm модул; P 10-9). По този начин, в допълнение към ролята си за увеличаване на производството на cDC2 при in vitro условия, които насърчават диференциацията на cDC1 и cDC2, RA потиска провъзпалителните генни програми.

дискусия

Оценихме ролята на RA и RAR сигнализирането при генерирането и транскрипционното програмиране на чревни специализирани подгрупи на cDC от чревни тропически прекурсори in vivo, както и в нов in vitro модел на развитие на cDC1 и cDC2. Нашите резултати показват, че RA действително действа върху клетките, за да оказва глобални ефекти върху генната експресия в линиите cDC1 и cDC2 и насочва транскрипционни програми, които контролират генерирането на подгрупи и експресията на функционални и фенотипни признаци, които определят чревната специализация на cDC1 и cDC2 in vivo. .

Комбинацията от Flt3L, GM-CSF и RA е достатъчна, за да стимулира in vitro развитието на чревни pre-μDCs до CD103 + cDC1 и cDC2, които са подобни на експресията на рецепторите на клетъчната повърхност на двете подгрупи, открити в чревната стена. Mayer et al. 32 показаха, че Flt3L и GM-CSF заедно подпомагат развитието на зависими от CD103 + cDC IRF8 и Batf3, но установихме, че cDC1, получен преди μDC, генериран в отсъствието на RA, има анормален фенотип на клетъчната повърхност и е по-малко подравнен с чревния cDC1 . в генната експресия като cDC1, генериран с трите фактора. В допълнение, културата с RA позволява образуването на двете чревни DC с подобни популации. В съответствие с нашите наблюдения при VAD мишки, увеличаване на концентрациите на RA до степента, посочена в проксималната SI (

10 nM), увеличава съотношението на cDC2 към cDC1 сред потомството преди μDC in vitro. По-високите концентрации допълнително повишават фенотипната специализация, както е посочено напр. Постепенно регулиране на CD101 и Clec9a. Тези наблюдения подкрепят критичната роля на RA в нормалното развитие на cDC и са в съответствие с особено важната роля на RA в специализацията на cDC в червата и GALT, където концентрациите на витамин А са най-високи. Моделът на култура, описан тук, трябва да улесни бъдещите изследвания на съответните механизми.

Нашите транскриптомични анализи потвърдиха, че потомството на pre-μDC, култивирани с RA, е по-скоро в генната експресия по-близо до чревните cDC1 и cDC2 in vivo, отколкото техните аналози, култивирани само с GM-CSF и Flt3L. Това беше особено очевидно при сравняване на подгрупи, базирани на експресията на гени, диференцирано експресирани от cDC1 vs. cDC2 in vivo. Интересното е, че in vitro произведеният cDC2 се отклонява повече от своите аналози in vivo, отколкото cDC1, въпреки че е генериран в присъствието на RA, което предполага, че те могат да бъдат особено чувствителни и зависими от местните влияния на околната среда. Съответно, предишни проучвания на генна експресия на cDC от червата, кожата, лимфоидните тъкани и кръвта показват, че cDC2 от различни тъканни места се различават много повече в генната експресия, отколкото cDC1. 37

Като цяло, нашите открития предполагат сценарий, при който регулирането на чревния DC RA започва в BM, където той положително регулира развитието на чревния прекурсор DC предшественик, pre-μDC. Pre-μDC е дом и води до cDC1 и cDC2 в SI. В чревната стена RA действа директно върху pre-μDC, вероятно чрез регулиране на определящите съдбата транскрипционни фактори, за да увеличи производството на cDC2 и да контролира програми за генна експресия в cDC1 и cDC2, които допринасят за тяхната функционална специализация и способността им да поддържат имунна хомеостаза и имунна координация.реакции на нахлуващи патогени.

методи

Проточна цитометрия. Пробите (едноклетъчни суспензии) първо бяха блокирани с флуоресцентно активиран буфер за сортиране на клетки (балансиран солев разтвор на Ханк с 2% фетален телешки серум), съдържащ 100-кратно разреждане на антимиши FcγIII/II рецепторни антитела (BD Bioscience, Сан Хосе, Калифорния ). и серум от плъх за предотвратяване на неспецифично свързване на моноклонални антитела. За оцветяване са използвани следните антитела: CD3-PECy7/CD3-биотин (145-2C11), CD19-PECy7/CD19-биотин (ID3), NK1.1-PECy7/NK1.1-биотин (PK136), CD49b-биотин (DX-5), Ly6G-биотин (1A8), Ter-119-биотин (Ter-119), B220-PECy7/B220-биотин/B220-PerCPCy5, 5 (RA3-6B2), MHCII-AF700/MHCII-FITC (M5/114, 15, 2)/MHCII-биотин (2G9), CD11c-PB (N418), a4p7-APC/a4p7-PE (DATK32), CCR9-APC/CCR9-PE/CCR9-FITC (242503), CD103 - PE/CD103-APC (M290), CD11b-AF700 (M1/70), CD8a-PE (53-6, 7), CD45.1-PerCPCy5, 5/CD45.1-APC, CD45.2-FITC/CD45.2 -PerCPCy5,5 (RA3-6B2), CD135-PE/CD135-PerCP-efluorF710 (A2F10), CD4-AF700 (RM4-5), Sirpa-FITC/Sirpa-PerCP-eFluor710 (P84), TLR3 - PE (11F8)), Clec4a4-PE/Clec4a4-биотин (33D1), CD101-PE (Mousei101), Clec9a-PerCP-eFluor710 (44D2) и Langerin-FITC. Всички експерименти, анализиращи cDC подгрупи, включваха предварителна обработка на живо, CD3e-, CD19-, NK1.1-, MHCII + и CD11c + .

Изолиране на клетки от тъкани

Сортиране на клетки. Pre-μDC и pre-cDC бяха сортирани от мишки, третирани с B16/Flt3L. 11 BM клетки бяха изолирани, както е описано по-горе, и обогатени чрез магнитно активирано сортиране на клетки, използвайки pan-DC комплекти от Miltenyi (Сан Диего, Калифорния). След това клетките бяха сортирани в Aria II или III (BD) за линия (CD3, CD19) и NK1.1) -CD11c int B220 + a4β7 + CCR9 - pre-μDC и линия (CD3, CD19, NK1.1 и B220) - CD11c int MHCII-Sirpa + pre-cDC.

Приемащо предаване. Сортираните pre-μDC (0, 5–1 x 106; CD45.2 или CD45.1) се инжектират ретроорбитално в получатели (CD45.1 или CD45.2). Приятните животни бяха жертвани 5 до 7 дни след предаването.

Ин витро култура. Pre-μDCs бяха скринирани от BM от мишки, третирани с Flt3L и култивирани при 0,5 милиона клетки на ml, 200 μl на гнездо в 96-гнездова плоча с плоско дъно или 2 ml на гнездо в 6-гнездова плака в цялостната модификация на Iscove Средата на Deulbecco. (10). % делипидиран фетален телешки серум, 1 х пеницилин/стрептомицин), допълнен със 100 ng ml -1 рекомбинантен Flt3L, 10 ng ml -1 рекомбинантен GM-CSF и RA при посочената концентрация. Медиите се смениха на ден 3.

Описан е анализ на активността на алдехиддехидрогеназата

Микрочип. Обща РНК беше изолирана от in vitro получени cDC1 и cDC2 в присъствието или отсъствието на 100 nM RA, използвайки метода на фенол-хлороформ екстракция, предоставен от Immgen (//immgen.org). Целостта на РНК се определя с помощта на Agilent Bioanalyzer (Stanford PAN Facility, Stanford, CA). Интактната обща РНК от всяка проба се използва за амплификация, маркиране и хибридизация чрез експресионен анализ. Пробите бяха хибридизирани с GeneChip мишка Gene 1.0 ST Array (Affymetrix, Санта Клара, Калифорния). За обработка и анализ на данни от микрочипове са използвани софтуерът GeneSpring GX 12.6 (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния) и Partek Genomic Suite (версия 6.6, Сейнт Луис, Мисури).

Статистически анализ. Статистическата значимост на разликите между двата набора от данни е оценена чрез t-тест на Student, освен ако не е посочено друго.