елементи

абстрактно

Целта на нашето проучване беше да се разработи неинвазивен пренатален тест за автозомно-рецесивни моногенни състояния и да се демонстрира цялостната му осъществимост и потенциал за клинична интеграция.

методи:

Осиновихме бременна жена и съпругът й, които имаха дете на пробанд с вродена глухота и получихме данни за секвениране на целевата област от полуостровно поле, използващо геномна и майчина плазмена ДНК от три поколения от това семейство. Разработена е стратегия, подкрепена с хаплотип, за да се определи дали плодът е наследил патогенни мутации в причинния ген GJB2. Родителският хаплотип е конструиран с помощта на трио стратегия, като се използват два различни процеса, а именно процесът на фазиране от баба и дядо и асистираният хаплотип и процесът на поетапност с аплодирания хаплотип на пробанда. След това феталният хаплотип е получен от данни за секвениране на майчината плазма и родителския хаплотип.

резултатите:

Нивата на точност на хаплотипите по баща и майка, получени чрез поетапно подпомагане на хаплотипа с помощта на баба и дядо, са съответно 99, 01. 97, 36% и процедурата за поетапно използване на аплодирания пробанд хаплотип дава малко по-ниска точност от 98, 73 и 96, 79%. Феталното наследяване на патогенния ген беше правилно получено и в двата процеса.

заключение:

Нашето проучване показва, че стратегията за неинвазивно пренатално тестване, основано на хаплотип за моногенни състояния, има потенциално приложение в клиничната практика.

Genet Med 16. 12, 972 - 976.

Основното

Тъй като в майчината циркулация е открита фетална ДНК на бозайници (cffDNA), са разработени различни неинвазивни пренатални анализи, за да се избегне рискът от традиционните инвазивни процедури за вземане на проби. 1, 2, 3, 4, 5, 6 Неинвазивните базирани на секвениране технологии са насочени към цитогенетичното ниво, бързо се развиват и са клинично достъпни. 4.5 Технологиите за моногенни заболявания обаче са все още в експериментален лабораторен етап. 7, 8, 9, 10

В нашето предишно проучване 10, ние предложихме силен математически модел, който може точно да възстанови както феталния генотип, така и феталния хаплотип в една стъпка, като по този начин се постига пълна характеристика на феталния геном. Това проучване обаче беше ограничено от строги изисквания за проби и не беше потвърдено от действителните клинични проби.

В това проучване бяха взети кръвни проби от бременна жена и близки роднини от три поколения на нейното семейство, включително баби и дядовци, родители и пробанд сестра, за да се извърши неинвазивно пренатално изследване за вродена глухота. Изградихме родителски хаплотипове, използвайки трио стратегия, и успешно извършихме пренатално тестване за фетален статус, използвайки информация, получена от баби и дядовци или пробанди. Нашето проучване предоставя надежден практически метод за неинвазивно пренатално изследване за вродена глухота чрез секвениране на плазмата на майката.

Материали и методи

Вземане на проби и идентифициране на причинителни мутации

Осиновихме бременна жена, нейната съпруга и три поколения от нейното семейство, които включваха пробанд дъщеря, чиито аудиограми показаха тежка до дълбока двустранна загуба на слуха. На семейството беше предоставено генетично консултиране и като опция беше предоставено пренатално тестване. Поради рисковете от вродена глухота на плода, родителите са избрали неинвазивен пренатален тест. Всички участници в това проучване бяха приети и получиха информирано съгласие в съответствие с Декларацията от Хелзинки. Етични одобрения са предоставени от съответните институционални съвети на всички участващи институции. Периферна кръв и амниотична течност са получени от бременна жена на 17 и 18/19 гестационна седмица. Взети са проби от периферна кръв от четири баби и дядовци за родителската хаплотипна конструкция. Полимеразната верижна реакция и последователността на Sanger бяха използвани за анализ на типа мутация в гена GJB2 ( Допълнителна таблица S1 и фигури S1 и S2 на линия). Бащата и дядото по бащина линия са носители на c.299delAT. Бременната майка и дядото по майчина линия са носители на c.235delC. Сондата е хетерозиготно съединение за мутации.

Подготовка и последователност на библиотеката

Геномната ДНК и на двамата родители и на четирите баби и дядовци от периферна кръв беше фрагментирана със соникатор. Маточната плазма се изолира, използвайки двустепенен протокол за центрофугиране. След приключване на окончателния процес на ремонта и A-tailing, адаптерите бяха лигирани към всеки край на ДНК фрагментите. ДНК кодът беше въведен във всяка проба по време на полимеразната верижна реакция за масивно паралелно секвениране. Улавянето на целевия регион беше извършено на специално проектиран 181, 37 M NimbleGen EZ масив (съдържащ цялата екзома, 1 M единични нуклеотидни полиморфизми (SNP) и основната област на хистосъвместимост) в съответствие с инструкциите на производителя. Библиотеките на Postcapture бяха секвенирани с помощта на платформата Illumina Hiseq 2000 с двойно крайно секвениране от 90 bp.

Изравняване и SNP повикване

Последователно сдвоените крайни показания се картографират в човешкия референтен геном (Hg19, GRCh37), използвайки SOAP2. 11 Показанията, които могат да бъдат картографирани на множество сайтове и които бяха усилени по време на процеса на полимеразна верижна реакция, бяха премахнати. След това направихме SNP повикване, използвайки софтуера SOAPsnp в целевата област. 12 Критериите за филтриране (покритие> 8 и стойност на качеството> 20) бяха определени, за да се гарантира точността на геномния генотип.

Оценка на циркулиращата концентрация на cffDNA

В локусите, които са хомозиготни и при двамата родители, но имат различни генотипове, феталният генотип е задължителен хетерозиготен съгласно законите на Мендел. По този начин, фракционната концентрация на фетална ДНК в майчината плазма може да бъде изчислена с локуси, за които майчиният генотип е хомозиготен и за който прогнозираният фетален генотип е хетерозиготен. Може да се опише като съотношение на удвоения брой специфични алели на плода, получени от бащата, към общия базов брой на други алели. 7, 10

Изграждане на родителски хаплотип

Създадохме родителския хаплотип, използвайки трио стратегия, основана на закона на Мендел. За процеса на асистирани хаплотипни баби и дядовци (GAHP) е създаден хаплотип по бащина линия с всяко трио от родители и баби и дядовци. За процеса на подпомагане на пробандата фаза на хаплотип (PAHP) родителските хаплотипове са конструирани с трио от баща, майка и пробанд.

Заключение за фетален хаплотип

Използвахме свързващата връзка, получена от родителските хаплотипове и базовото разпределение, изчислено чрез плазмено секвениране, за да извлечем вродения фетлотип. Вероятностите за комбинации от хаплотипни кандидати са изчислени за всеки локус. Според характеристиките на рекомбинацията на процеса на гаметогенеза, ние изчислихме вероятностите за трансфер, използвайки разстоянието между съседни места, за да създадем скрит модел на Марков. В процеса на декодиране на този модел използвахме алгоритъма на Витерби, за да намерим най-вероятната последователност от скрити състояния и да изведем наследствени хаплотипни и рекомбинационни феномени в плода. 13

резултатът

Помирение и изграждане на родителския хаплотип

След улавяне на целевата зона

20-кратни до 30-кратни продукти за обогатяване бяха подложени на последователност от 90 bp двойно крайно секвениране ( Допълнителна таблица S2 на линия). Всички показания бяха приведени в съответствие с човешкия референтен геном и беше направено повикване за SNP. Според информацията за SNP, делът на плазмената концентрация на cffDNA в майката е оценен на 15,10%.

Родителските хаплотипове са конструирани с помощта на две стратегии: GAHP процес и PAHP процес. Използвайки GAHP, район от 104, 91-Mb родителски хаплотипове беше успешно фазиран, със 149 628 маркера за кандидатстване, разпределени в целия геном. С помощта на PAHP беше успешно създаден регион от 104,93 Mb, който съдържа 168167 маркера за кандидатстване.

Приспадане на фетално наследство от хаплотип

В плазмата на майката генерирахме скрита верига на марковски модел, използвайки данните за родителския хаплотип и плазменото секвениране ( Фигура 1 ), при които условията са скрити от истински фетални генотипове, а наблюдаваните условия са смеси от дълбочина на майчината последователност и фетални плазмени генотипове. След процеса на декодиране получихме наследствен хаплотип и рекомбинационни събития в плода. Използвайки родителския хаплотип, получен от GAHP, ние успешно извадихме 126 600 фетални локуса и установихме, че феталният наследствен хаплотип е имал 33-кратна рекомбинация, а наследствената майка е имала 139 пъти. Използвайки стратегията PAHP, получихме 146 103 локуса с 60- и 181-кратна рекомбинация в наследения хаплотип по баща и майка ( Допълнителна фигура S4 и таблица S3 на линия).

неинвазивно

Блок-схема на неинвазивна стратегия за пренатално тестване . ( а ) Генетична карта на това семейство. б ) блок-схема на експериментален тръбопровод и биоинформатика. cffDNA, безклетъчна фетална ДНК; HMM, скрит модел на Марков.

Изображение в пълен размер

За да оценим общата точност на прогнозирания фетален хаплотип, създадохме стандартен хаплотип, използвайки трио стратегия с информация за родители и клетки на околоплодната течност ( Допълнителна таблица S3 на линия). Използвайки GAHP, 98, 15% от хетерозиготните локуси на бащиния хаплотип бяха правилно получени в 67 978 локуса, а 95, 19% от хетерозиготните локуси на хаплотипа на майката бяха правилно получени в 69 346 локуса. За PAHP резултатът е бил правилен за 97, 56% от хетерозиготните локуси на бащиния хаплотип и 94,00% от хетерозиготните локуси на майчиния хаплотип, което е приблизително 1% по-малко от резултатите, получени със стратегията GAHP (онлайн Таблици S1 и S4 на линия). ).

Оценка на хаплотипните изводи за грешки

Родителският хаплотип, получен от процеса PAHP, съдържа рекомбинация в пробанда. Така полученият от PAHP фетален хаплотип беше рекомбиниран два пъти. Той показва по-високи събития на рекомбинация в сравнение с извлечения от GAHP фетален хаплотип, което може да доведе до повече хаплотипни грешки около събитията на рекомбинацията. За по-нататъшно изследване на този ефект от събитията на рекомбинация, ние изчислихме степента на грешка на вариациите с единични нуклеотиди във всяка 1-Mb област в генома ( Допълнителна фигура S4 и таблица S5 на линия). В процеса на GAHP 23, 87% от грешките в бащиния хаплотип и 11, 74% от грешките в хаплотипа на майката са били разположени на разстояние 1 Mb около точките на прекъсване. В процеса PAHP обаче 30,12% от грешките на бащиния хаплотип и 23,66% от грешките на хаплотипа на майката са концентрирани около точките на рекомбинация на фрактури на плода и 9,83% от грешките на бащиния хаплотип и 11, 83% от грешките на хаплотипа. Броят на грешките в хаплотипа на майката е близо до точката на рекомбинация на пробанда. Поради това стигнахме до заключението, че стратегията PAHP обогатява рекомбинационните грешки от пробанда, което показва по-ниска точност в сравнение със стратегията GAHP.

В допълнение към ефекта от събитията на рекомбинация, грешките в извода са свързани и с фазовите грешки на родителския хаплотип и анормални концентрации на cffDNA. В родителския процес на фазово хаплотип грешките при извеждането може да се дължат на ниското качество на информацията за SNP на баби и дядовци, родители и пробанди и биха били насложени от процеса на фаза. Следователно, ние използвахме хаплотипите на родителите, пробанда и плода, за да възпроизведем процеса на рекомбинация и открихме няколко спорадични рекомбинационни точки, които показват само изолиран рекомбинационен сигнал в области, по-малки от 100 kb. В стратегиите за GAHP и PAHP приблизително 29% от грешките включват тези локуси, което предполага, че точното определяне на SNP в геномната ДНК е важно за целия процес на анализ. За разлика от геномната ДНК, cffDNA в майчината плазма е фрагментирана от естествено разграждане, характеризиращо се с нестабилна част от човешкия геном. Намерихме екстремни локуси на концентрация на cffDNA (извън 99% доверителния интервал на широкия профил на генома) и установихме, че приблизително 30% от грешките се приближават.

Неинвазивно пренатално изследване за вродена глухота

Проведохме пренатално тестване за вродена глухота въз основа на вроден хаплотип в гена GJB2. Тук дефинирахме родителските хаплотипове като hap0 и hap1, за да разграничим патогенността. В GAHP бащиният патогенен алел, наследен от дядото по бащина линия, се нарича f0, а непатогенният алел се нарича f1. Патогенният алел на майката се нарича m0, а другият се нарича m1. За да се кодира скрит модел на Марков, наследяването на феталния хаплотип по отношение на гена GJB2 е f1 и m0, което показва, че плодът е хетерозиготен носител на c.235 delC мутация. В PAHP, тъй като пробандът беше типичен пациент с вродена глухота, ние определихме родителските алели, наследени от пробанда, като hap0, а останалите бяха определени като hap1. И накрая, феталният хаплотип в гена GJB2 също е f1 и m0, което е в съответствие с резултата от стратегията GAHP ( Фигура 2 ). Докладът за диагнозата на Китайската обща болница PLA (Пекин, Китай) подкрепи нашето заключение ( допълнителна фигура S3 на линия). В това проучване генетичният тест се основава на анализ на фетален хаплотип вместо подробен генотип.

Резултати от неинвазивен тест за вродена глухота . ( а ) Наследени пътища на родителски алели, получени чрез стратегията GAHP. ( б ) Наследени пътища на родителски алели, получени от стратегията PAHP. ( ° С ) Уголемен изглед на локусите около гена GJB2, използвайки както стратегии GAHP, така и PAHP; и двете стратегии показват, че плодът е наследил алелите hap f1 и hap m0. Във всички графики сините елементи представляват родителски алели, а червените - майчини алели (светлите цветове означават наследство от баби, а тъмните цветове означават наследство от баби и дядовци). Редове под нулата (черни линии) показват, че плодът е наследил патогенния алел, а линиите над нулата показват, че плодът е наследил доброкачествения алел. GAHP, фаза на хаплотип от баби и дядовци; PAHP, подпомагане на пробанд фаза на хаплотип.

Изображение в пълен размер

дискусия

Приблизително 1% от възрастните носят мутантни алели. Сред новородените мутантните алели заедно представляват приблизително 20% от детската смъртност и

10% от детските хоспитализации. Необходимо е да се разработят ефективни диагностични методи, по-специално пренатална диагностика, за да се подобри качеството на живот на обществото като цяло. Вродената глухота е често срещано клинично генетично заболяване с честота 1-3% при новородени. Ранното пренатално тестване на загуба на слуха може да предостави на семействата повече възможности за обучение и също така да предостави време за поставяне на основите за генетична терапия в близко бъдеще. 17, 18, 19

В това проучване ние използвахме тристепенна стратегия или с баба, и с баба, или с пробанд, включително GAHP и PAHP методи. И двата метода могат да идентифицират правилните родителски хаплотипове, за да се осигури обвързваща връзка за получаване на вроден фетален хаплотип, въпреки че точността на PAHP е по-ниска поради натрупването на рекомбинация в потомството. Следователно нашият метод е подходящ за неинвазивни пренатални тестове на семейства с болести на Мендел, които могат да бъдат получени от родителски хаплотипове на баби и дядовци или пробанди. От друга страна, секвенирането на целевата геномна ДНК не изисква сложна експериментална процедура, като описаните по-рано методи, поддържани от хаплотип, и е рентабилно, ако се проектира подходящ масив. Времето за изпълнение, включително процеса на вземане на проби и тестване на платформата HiSeq2500, също може да бъде по-малко от 1 седмица, а анализът на биоинформатиката може да се извърши в рамките на 1 ден, осигурявайки този тип процедури за големи клинични приложения. 8, 9

Все още обаче има няколко недостатъка на този метод, които трябва да се имат предвид. Първо, създадохме родителски хаплотип, базиран на данни от трио последователности в едно семейство, което силно ограничава възможността за използване на нашия метод за семейства с един родител, за които тези данни не са налични (въпреки че в повечето клинични случаи засегнатото дете е болно). причина за пренаталното тестване). Второ, нашето тестване се основава на окончателната значимост между болестта и свързания с нея ген, така че може да се използва само за болести, за които патогенният ген на болестта е напълно проучен. Следователно нашият метод е приложим главно за генетичните заболявания на Мендел. Тепърва трябва да бъдат разработени ефективни алгоритми за идентифициране на мутации de novo. Съществуват и значими етични проблеми, свързани с неинвазивното определяне на пренаталния геном, особено когато преминем към по-изчерпателни и удобни методи. Съществуват обаче много клинични сценарии, при които този подход би бил полезен, включително тестване за фатални заболявания или състояния, които могат да доведат до други здравословни усложнения.

Като цяло, ние предложихме обещаваща неинвазивна стратегия за пренатално тестване за вродена глухота чрез масивно паралелно секвениране на майчината плазма. Базираният на хаплотип подход, описан в това проучване, може да бъде разширен до неинвазивно пренатално тестване на повечето моногенни заболявания.

разкриване

XL, HG, FC, YZ, WX, XP, SC, PL, CZ, JC, HJ, XX и WW са служители на BGI-Shenzhen. Други автори не декларират конфликт на интереси.