елементи

абстрактно

Преобладаващите наситени мастни киселини (SFA) в човешките храни са лауринова киселина (LA, C12: 0), миристинова киселина (MA, C14: 0), палмитинова киселина (PA, C16: 0) и стеаринова киселина (SA, C18: 0 ). ). Целта на това проучване е да се определи дали диетите, съдържащи отделни SFA, заедно с излишък от прости въглехидрати предизвикват промени в остеоартрит (ОА) на колянните стави и симптоми на метаболитен синдром при плъхове. Плъховете са били хранени или с диета с царевично нишесте, или с проста въглехидратна диета заедно с 20% LA, MA, PA, SA или говежди лой в продължение на 16 седмици. Плъхове, хранени с говежди лой, SA, MA или PA диети показват признаци на метаболитен синдром, а също така показват деградация на хрущяла и OA-подобни субхондрални костни промени. За разлика от това, заместването на LA телешки лой намалява симптомите на метаболитния синдром заедно с намаленото разграждане на хрущяла. В допълнение, PA и SA, но не LA, увеличават освобождаването на матрични сулфатирани протеогликани в култури от говежди хрущялни експланти или човешки хондроцити. В заключение показахме, че SFA с по-голяма верига при плъхове индуцират метаболитен синдром и промени в коляното, подобни на OA. По този начин диетите, съдържащи SFA, са изключително важни за развитието или превенцията както на ОА, така и на метаболитния синдром.

Затлъстяването е прекомерното съхранение на мазнини в тялото, което е основен компонент на метаболитния синдром, съзвездието на хипертония, диабет, дислипидемия и мастни чернодробни заболявания, което увеличава риска от сърдечно-съдови заболявания 11. Въпреки че е общоприето, че SFA като група насърчава коремното затлъстяване, дислипидемия, инсулинова резистентност, нарушен глюкозен толеранс и системно възпаление 12, тази роля на SFA при затлъстяване, диабет и сърдечно-съдови заболявания сега е поставена под въпрос. Последните проучвания показват, че предизвиканите от SFA отговори зависят от дължината на веригата, с ясни разлики в биологичните отговори между лауринова киселина и палмитинова киселина 13. Ролите на отделните хранителни SFA в ОА обаче не са ясно определени.

Нашите предишни проучвания съобщават, че диета с високо съдържание на въглехидрати и мазнини (H, съдържаща предимно фруктоза и говежди лой) в продължение на 16 седмици при млади мъжки плъхове Wistar имитира симптомите на човешкия метаболитен синдром, включително коремно затлъстяване, повишено общо телесно тегло и повишена плазма. липиди и кръвно налягане, нарушен глюкозен толеранс и инсулинова чувствителност, мастно чернодробно и сърдечно-съдово ремоделиране 14. Това проучване изследва ролята на C12 до C18 SFA (лауринова киселина (LA; C12: 0), миристинова киселина (MA; C14: 0), палмитинова киселина (PA; C16: 0) и стеаринова киселина (SA; C18: 0), както и говежди лой (главно SA и трансмастни киселини) за симптоми на метаболитен синдром и за развитие на ОА.

резултатът

SFA за метаболитен синдром

Плъховете, хранени с високо въглехидратна диета, заедно с лой, съдържащ както наситени, така и транс-мазнини (диета Н), развиват промени, свързани с човешкия метаболитен синдром, включително коремно затлъстяване, хиперлептинемия, хиперлипидемия и чернодробна дисфункция, в сравнение с царевичната диета. (диета С). 1), обаче, плъховете Н не показват хипергликемия и хиперинсулинемия в сравнение със С плъхове. Диетата С има ниска енергийна плътност и вероятно поради тази причина приемът на храна е бил по-висок при плъховете С от всички останали групи. Въпреки че приемът на храна е бил по-висок при плъхове C, енергийният прием е бил по-висок при всички групи с високо съдържание на мазнини, отколкото при плъховете C в ред C (HLA = H)

киселини

( A ) Хистологична оценка на колянните стави. Всички изображения са получени при 20-кратно увеличение (n = 8 на група), което представлява медиалното плато на тибията. Оцветяването с Safranin O/Fast Green показва степента на загуба на протеогликан сред различните диетични групи. Представително имунохистохимично оцветяване показва броя на положителните клетки за ACAN, MMP13, COL10 между различни диетични групи. Анализът на апоптотичните хондроцити между различните диети е количествено определен с помощта на TUNEL анализа (показани са DAPI и TUNEL изображения). Броят на TUNEL-положителните клетки на участък на ставния хрущял се определя чрез флуоресцентна микроскопия. За всяко имунооцветяване се включва отрицателна контрола или без първичното антитяло, или с изотип-съвпадащ IgG вместо първичното антитяло. ( Б. ) Тежестта на разграждането на ставния хрущял е оценена с помощта на системата за точкуване на Манкин. ( ° С ) Количествени хистоморфометрични анализи. Общите положителни клетки на 100 клетки в хрущяла са преброени с помощта на ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Всички стойности са изразени като средна стойност ± SD. Скалата е 100 μm. (P

( A ) 3-D изображение на цели коленни стави на плъхове и реконструирани аксиални изображения на напречно сечение на микро CT CT (вложка) на интересуващия регион, т.е. медиалното и страничното плато на тибията, показващи променена субхондрална костна архитектура (жълти стрелки показват анормална кост ) морфологични промени). За морфометрични анализи ( Б. ) фракцията на костния обем (BV/TV) се изчислява като съотношението на сегментирания костен обем (BV) към общия обем (TV) на региона от интерес. Освен, че ( ° С ), също беше изчислена костната минерална плътност (КМП) на региона от интерес. Всички стойности са изразени като средна стойност ± SD (P

( A ) КОНСЕРВА, ( Б. ) COL10A, ( ° С ) MMP13, ( д ) ADAMTS4, ( Е. ) ADAMTS5 a ( F Нивата на иРНК на RUNX2 бяха оценени чрез RT-PCR както в не-третирани с IL-1β, така и в третирани с IL-1β пелети. Всички експериментални проби бяха извършени в три екземпляра. Всички стойности са изразени като средна стойност ± SD (P

( A ) Оцветяването на сафранин O/Fast Green от говежди експланти от едър рогат добитък показва загуба на протеогликани в различни диетични групи както в третирани с IL-1β, така и в третирани с IL-1β експланти. ( Б. ) Количественото определяне на освобождаването на sGAG в супернатанта се извършва чрез DMB анализ, който показва, че третирани с PA и SA експланти увеличават освобождаването на sGAG в средата както на ден 3, така и на ден 7 в сравнение с други диетични групи. В допълнение, зоната за изчерпване на sGAG ( ° С ) в хрущялните експланти е най-висок при лекуваните с SA експланти, независимо от лечението с IL-1β (Р 16. Честотата на ОА също се е увеличила значително за подобен период от време 17, което води до добре документирана подкрепа за схващането, че затлъстяването е модифицируемо рисков фактор за честота и прогресия). Преобладаването на затлъстяването и ОА е най-високо при пациенти над 65-годишна възраст, нарастващ сегмент от световното население, и тъй като и затлъстяването, и ОА намаляват мобилността и увеличават сърдечно-съдовия риск, загубата на тегло и упражненията са считани за ключови компоненти в лечението на пациенти със затлъстяване с ОА 18. Следователно разбирането на общите медиатори за затлъстяване и ОА е ясно от значение за осигуряване на реалистични и устойчиви възможности за лечение на свързано със затлъстяването ОА.

Ограниченията на това проучване включват, че не сме измервали синовиални морфологични промени или промени в концентрациите на цитокини в синовиалната течност. Тези два допълнителни параметъра могат да допринесат за разбирането на местните промени, причинени от възпаление в диетите с SFA и по този начин да подобрят разбирането за индуцирана от затлъстяването OA.

В заключение, това проучване предоставя доказателства, че SFA може да предизвика подобни промени в метаболитния синдром при OA. Тези промени корелират с плазмените концентрации на лептин и инсулин, които са замесени в затлъстяването, диабет тип 2 и ОА. Нашите данни показват, че заместването на традиционната диета, съдържаща LA, получена от кокосов орех, с PA, получена от палмово масло или SA, получена от животински мазнини, има потенциал да влоши развитието както на метаболитния синдром, така и на OA. Освен това са необходими клинични проучвания при хора, за да се определи дали заместването на PA и SA в LA диетата потиска или обръща развитието както на OA, така и на метаболитния синдром, особено затлъстяването и хипертонията.

методи

Проучване и дизайн на диетата

Измерване на метаболитни променливи

Извършени са ежедневни измервания на телесното тегло и приема на храна и вода, за да се наблюдава ежедневното здраве на плъховете. Ефективността на преобразуване на фуража (%) се изчислява, както е описано по-горе 14. Процентното наддаване на тегло за 16 седмици се изчислява като разлика в телесното тегло между ден 0 и ден 112. Коремната обиколка се измерва на всеки 4 седмици, като се използва стандартна измервателна лента под лека анестезия със Zoletil (плобетамин 10 mg/kg, золазепам 10 mg/kg ip). Virbac, Peakhurst, NSW, Австралия).

Тестове за орален глюкозен толеранс се извършват върху плъхове, както е описано по-горе. Накратко, плъховете бяха лишени от храна в продължение на 12 часа преди измерване на базалната кръвна глюкоза, последвано от орално изследване с 40% воден разтвор на глюкоза и концентрации на глюкоза отново на 30, 60, 90 и 120 минути, с AUC (площ под кривата) изчисление от тях измервания. Систоличното кръвно налягане се измерва на всеки 4 седмици с лека седация със Zoletil (10 mg/kg tiletamine, 10 mg/kg zolazepam, ip) 14. Проведена е ехокардиография за измерване на сърдечно-съдовата структура и функция14. Използвана е непряка калориметрия за измерване на консумацията на кислород и производството на въглероден диоксид, използвайки 4-камерна система Oxymax (Columbus Instruments, Columbus, OH) с по един плъх на камера. По време на измерването плъховете са имали свободен достъп до храна и вода. Консумацията на кислород (VO 2) и производството на въглероден диоксид (V CO 2) се измерват индивидуално от всяка камера. Съотношението на дихателния обмен (RER = V CO2/VO2) беше изчислено от софтуера Oxymax (v. 4.86). Окисляването на въглехидратите води до RER от 1,00, докато окисляването на мастните киселини води до RER от около 0,70 38. Разходът на енергия се изчислява въз основа на оценка на кислородния обмен до въглероден диоксид, който възниква по време на метаболитната обработка на храната.

Плъховете бяха умъртвени след 16 седмици, използвайки Lethabarb® (100 mg/kg натриев пентобарбитон, ip). След евтаназия се събира кръв за плазмена изолация и плазмата се съхранява при -20 ° С преди по-нататъшен анализ.Изолират се сърца, за да се подготви сърцето на Лангендорф за измерване на константата на диастолична скованост 14. Впоследствие тъкани като черен дроб, лява камера (със септом), дясна камера и коремни мастни накладки (включително ретроперитонеална, епидидимална и оментална) се отстраняват за претегляне и се изразяват в mg/mm дължина на пищяла. Плазмените концентрации на лептин, инсулин, общ холестерол, триглицериди и неестерифицирани мастни киселини (NEFA) бяха измерени, както е описано по-горе.

Оценка на ставния хрущял

Тест за апоптоза на TUNEL

Терминалната дезоксинуклеотидил трансфераза (TdT) dUTP Nick-End маркиране (TUNEL) се използва за идентифициране на клетки, които показват разграждане на тяхната ДНК по време на апоптоза. Тъканните срези първо се проникват с протеиназа К в продължение на 30 минути при 37 ° С. След това предметите се измиват с PBS и анализът се извършва, като се използва протоколът на производителя (Roche, Германия). Секциите бяха инкубирани с DNase за 10 минути при стайна температура като положителен контрол. За полуколичествен анализ на данни положителните клетки от различни области на наблюдение бяха преброени и нормализирани до броя на клетките на 100 общо клетки във всяка група, като се използва ImageJ (NIH, Bethesda, MD). .

Оценка на субхондралните костни промени

Извършен е микро-КТ за анализ на субхондралните костни промени. Бедрената кост и пищяла са сканирани чрез микро-CT (Scanco μCT 40, Scanco Medical, Швейцария) с изотропен размер на воксела от 18 μm с напрежение 55 kV и ток от 145 μA с 0,5 mm алуминиев филтър. Времето на експозиция е 1180 ms и вграденият софтуер Scanco е използван за сегментиране на файла с данни 39. Ръчни зони на интерес (ROI) са начертани около анатомичния контур в субхондралната костна област в медиалното и страничното плато на тибията. Обемът на лихвите (VOI) се състои от набор от ROI (25 раздела). VOI започва под субхондралната плоча, която се простира дистално към растежната плоча. Изчислете съотношението на костния обем към общия обем (BV/TV) и костната минерална плътност (BMD) на VOI.

Анализ на остеоцитите

Средният празен остеоцитен лактон (Avg OS.L) и средното остеоцитно ядро ​​(Avg OS.N) са отчетени за единица площ (mm 2) в субхондралната костна област на медиалното плато на тибията с помощта на ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Лечение на хондроцити и хрущялни експланти със SFA

Изготвяне на ДФЗ

LA, MA, PA и SA са закупени в търговската мрежа с най-високата налична чистота (Sigma-Aldrich, GC-пречистена, химически синтезирана). Като носител е избран говежди серумен албумин (BSA) (без мастни киселини, Sigma Aldrich). Сложните разтвори на SFA-BSA бяха приготвени, използвайки протокола, описан по-горе 6. Отделните SFA се разтварят в 100% етанол при 70 ° С, за да се получи 200 mM основен разтвор. След това основният разтвор се разрежда 1:10 в 10% (w/v) BSA, приготвен с модифицираната от Dulbecco среда на Eagle (DMEM) в продължение на 10 минути при 55 ° C. Полученият SFA разтвор (20 mM) се филтрира стерилно преди нанасяне върху клетката култури (0, 45 μM филтър), използвайки протокола, описан по-горе 6. Контролният носител (отрицателна контрола) беше BSA без мастни киселини със същата концентрация на етанол.

Хондроцитна пелета и говежди експлант

Хондроцитите бяха събрани с помощта на ензимно храносмилане и култивирани с помощта на нашите публикувани протоколи 39. Накратко, биопсии на ставния хрущял са получени от първични пациенти с ОА, подложени на операция за подмяна на коляното в болница „Принс Чарлз“ (Бризбейн, QLD, Австралия). Всички биопсии на хрущяла са взети от част от повърхността на бедрената кондила, за която хирургът смята, че прилича на непокътнат и здрав хрущял. Петимата дарители са мъже на възраст 60–65 години и всички са предоставили писмено информирано съгласие. Изследването е одобрено от болницата „Принс Чарлз“ и Комитетите по хуманна етика на Технологичния университет в Куинсланд. Всеки образец на хрущял беше допълнително охарактеризиран и оценен според оценката на Манкин, като за по-нататъшни експерименти бяха използвани само проби с оценки 0–1 (здрав хрущял).

Хрущялът се дисектира от костта и се смила с разтвор на колагеназа 2 (Invitrogen, Lakewood, NJ) в продължение на една нощ в хранителна среда DMEM за изолиране на хондроцитите на ставния хрущял (ACC). След разграждане, АСС (2,5 × 105 клетки) се гранулират чрез центрофугиране в 15 ml епруветки Falcon и се култивират в триизмерна (3D) система за култивиране на пелети 39, в продължение на 14 дни в хондрогенна среда в присъствието или отсъствието на различни SFA.

За проучвания на експлантата по говедата, в деня на клането са получени пресни коленни стави за възрастни говеда (n = 3). След това от колянните стави бяха взети експланти на ставния хрущял с пълна дебелина без субхондралната кост. След това хрущялните дискове бяха асептично дисектирани с помощта на 4-мм дермален удар. Дисковете се култивират в DMEM и се допълват с 10% фетален говежди серум (FBS) и антибиотици при 37 ° C с 5% CO 2 за 48 часа.

След това пелетите и дисковете бяха стимулирани с всеки SFA (крайна концентрация: 30 μg/ml, получена от MTT анализ - данните не са показани). Отрицателната контрола, в която не се добавя SFA, се третира само с BSA носител. За да се изследват ефектите на SFA и възпалителните цитокини, някои ACC пелети и говежди хрущялни дискове бяха третирани с IL-1β (10 ng/mL) в присъствието или отсъствието на различни SFA. След ден 3 и ден 7 средата се събира и съхранява при -80 ° С за количествено определяне на сулфатирани гликозаминогликани. Хрущялните дискове и ACC пелетите са обработени по-късно за хистологичен анализ и количествен PCR анализ в реално време (qPCR). За по-нататъшна оценка на отговорите на определени SFA, различни концентрации (10 μM, 30 μM, 60 μM и 90 μM) от PA и SA са добавени към пелети от хондроцити както в отсъствие, така и в присъствието на IL-1β (10 ng/ml ). След ден 3 и ден 7 средата се събира и съхранява при -80 ° C за количествено определяне на сулфатирани гликозаминогликани (sGAG). В допълнение, за да се оценят ефектите на IL-1β, използван в това проучване, хондроцитните пелети са третирани с различни концентрации на IL-1β (1-10 ng/ml). Средата за ден 3 и ден 7 се събират и съхраняват при -80 ° C за количествено определяне на sGAG.

Анализ на сулфатирани гликозаминогликани (sGAG)

За да се измери освобождаването на sGAG, супернатантите бяха събрани от ямките, съдържащи дискове от говежди хрущял или хондроцитни пелети, третирани със или без SFA на ден 3 и ден 7. SGAG беше измерен, използвайки метода на диметилметиленовото синьо (DMB) с комплекта (Blyscan ™ Biocolor Ltd) следвайки инструкциите на производителя. Зоната на изчерпване на sGAG в хрущялните експланти се определя с помощта на изображения на оцветяване на Safranin O и се измерва с помощта на ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Екстракция на РНК и PCR в реално време

Общата РНК се екстрахира с помощта на TRIzol реагент (Invitrogen), третира се с DNase и се пречиства съгласно протокола на производителя с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA беше синтезирана от 1 μg от общата РНК съгласно протокола на производителя, използвайки SensiFAST cDNA Synthesis Kit. Количествената PCR 41 в реално време, използвайки SYBR Green откриваща химия, беше извършена върху ABI 7500 Fast Real Time PCR система (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Бяха проведени анализи на кривата на стопяване на всички PCR продукти в реално време и беше показано, че се получава единичен ДНК дуплекс. Всички проби бяха измерени в три екземпляра и средната стойност на всички експериментални проби беше взета за сравнителен анализ. Количествените измервания на всички праймери, използвани в това проучване, бяха определени с помощта на метода (2 -ΔΔ Ct) и 18 s и експресия на β-актин бяха използвани като вътрешен контрол, както е описано по-рано от нашата група 39, 41, 42, 43 .

статистика

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на Graphpad Prism. Данните са представени като средно ± стандартно отклонение (SD) за всички променливи и са анализирани с ANOVA метод. За оценка на статистическата значимост е използван дисперсионен анализ с повтарящи се мерки с post hoc тестове (Dunnett's/Bonferroni). Нивото на значимост е определено на P