липсата

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • U мишка Slc39a14-/- sa развиват прогресивни поведенчески и двигателни дефицити
  • Загуба на изразяване Slc39a14 води до натрупване на Mn
  • Загуба на изразяване Slc39a14 променя експресията на различни Mn транспортери в няколко тъкани
  • Специфично за хепатоцитите делеция на експресия Slc39a14 не води до натрупване на Mn със стандартен Mn в диетата
  • Високият Mn в диетата не води до натрупване на Mn в черния дроб в специфични за хепатоцитите хепатоцити Slc39a14- изхвърлени мишки.
  • дискусия
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • видеоклипове
  • Допълнителен филм S1
  • Допълнителен филм S2
  • Допълнителен филм S3
  • Допълнителен филм S4
  • Допълнителен филм S5

елементи

  • Механизми на заболяването
  • Транспорт на протеини

абстрактно

В тялото металната хомеостаза е сложен процес, включващ множество транспортери, които са строго регулирани от нивото на техните субстрати и/или други условия на околната среда. Мозъкът е особено чувствителен към токсичните ефекти на металите и металите лесно се натрупват в мозъка, когато метаместезисната хомеостаза е нарушена [1, 2, 3]. Манганът (Mn), който е съществен елемент за хората, често се среща в мозъка, костите, черния дроб, панкреаса и бъбреците, а дисбалансът на Mn е свързан с нарушена мозъчна функция [4, 5, 6, 7]. Към днешна дата са идентифицирани няколко транспортни протеина, които играят роля за поддържане на нивата на Mn, включително двувалентен йон транспортер-1 (DMT1) [8, 9, 10, 11], феропортин (Fpn1) [12], SLC39A8 (известен също като ZIP8). [13, 14], SLC30A10 (известен също като ZnT10) [15, 16, 17] и SLC39A14 (известен също като ZIP14) [4]. Точните молекулярни механизми, лежащи в основата на Mn хомеостазата, не са добре известни.

SLC39A14 се появи за пръв път за ролята си в абсорбцията на цинк в черния дроб в отговор на остро възпаление и инфекция [28]. Мутациите в SLC39A14 могат да предизвикат симптоми, подобни на паркинсонизъм (PD-подобни) в резултат на натрупване на Mn в различни мозъчни структури, особено в globus pallidus и стриатум [4]. По същия начин мутациите в други Mn транспортери, като SLC30A10, също могат да предизвикат Mn невротоксичност и свързани симптоми [15, 29, 30]. Въпреки установената роля на Mn хомеостазата за поддържане на здравето, специфичната за тъканите роля in vivo на транспортерите на Mn не е ясно определена.

Тук съобщаваме, че глобалните мишки с нокаут на Slc39a14 (Slc39a14 -/-) и специфични за нокаути на Slc39a14 (Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre +) мишки имат различни Mn фенотипи и разпределение на тъканните метали. По-специално, въпреки че мишките Slc39a14 -/- рекапитулират хиперманганезиемията, която се появява при пациенти с PD-подобен синдром [4], не се наблюдава натрупване на Mn в мозъка или други тъкани на мишки Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre +, които имат значително по-ниски нива на Mn в черния дроб. Тези открития дават нова представа за физиологичната роля на SLC39A14 като основен вносител на Mn в черния дроб и хвърлят нова светлина върху клиничните ефекти от нарушаването на Mn хомеостазата.

резултатът

Slc39a14 -/- мишките развиват прогресивни поведенчески и двигателни дефицити

В съответствие с предишни доклади [31, 32], нашите хомозиготни планери Slc39a14 (Slc39a14 -/-) са жизнеспособни и нямат видими морфологични аномалии при раждането. До 4-седмична възраст обаче тези мишки започват да показват признаци на прогресивен произволен тортиколис и двигателни дефицити (Фигура 1а; допълващ филм S1, допълващ филм S2, допълващ филм S3, допълващ филм S4, допълващ филм S5). В сравнение с котилата от див тип, мишките Slc39a14 -/- имат по-ниско телесно тегло на възраст от 8 седмици (Фигура 1b). На шестмесечна възраст, Slc39a14 -/- мишките започнаха да показват признаци на дистония с прогресираща неспособност да координират двигателната си активност (Фигура 1c-i); тези симптоми са подобни на PD-подобно двигателно увреждане при пациенти с мутация в SLC39A14 [4].

Загубата на експресия на Slc39a14 води до натрупване на Mn

Съобщава се, че Slc39a14 пренася няколко метала, включително Mn [4], цинк (Zn) [31] и желязо (Fe) [40]. Следователно, ние използвахме индуктивно куплирана масова спектрометрия (ICP-MS) за измерване нивата на различни метали в Slc39a14 -/- и мишки от див тип [41, 42, 43]. Интересното е, че в сравнение с контролите от див тип, съвпадащи с възрастта, 48-седмичните мишки Slc39a14 -/- са имали значително по-високи нива на Mn в широк спектър от тъкани, включително серум, мозък, бъбреци, бели дробове, сърце и далак (Фигура 2а); Нивата на Mn в черния дроб и червата са сходни при мишки от див тип и Slc39a14 -/-. Не открихме значителни разлики между мишки от див тип и мишки Slc39a14 -/- по отношение на Fe, Zn или Cu в която и да е тъкан (Фигура 2b-d), с изключение на леко, но подчертано повишаване на серумните нива на Fe (Фигура 2b Като цяло тези данни предполагат, че Slc39a14 е предимно транспортьорът на Mn.

При мишки slc39a14 -/- Mn се натрупва в различни тъкани. ( а - д ) Mn нива ( а ), Fe ( б ), Zn ( ° С ) и Cu ( д ) бяха измерени в посочените тъкани от див тип (WT) и Slc39a14 -/- (KO) мишки на> 24 седмици чрез ICP-MS (n = 4 мишки/група). В точка и да обърнете внимание на прекъсването на оста y за Mn серум. * P -/- третирани в продължение на четири седмици с Na2 CaEDTA (370 mg/kg телесно тегло) или физиологичен разтвор (n = 8 - 12 мишки/група, възраст 5 месеца). е ) резултати от ротарод тест при мишки Slc39a14 -/- третирани в продължение на четири седмици с Na2 CaEDTA или физиологичен разтвор (п = 8-12 мишки/група, възраст 5 месеца). IN д а е, * P -/- Mn нива в мозъка, които са

10 пъти по-високи от контролните мишки от див тип, съобразени с възрастта. Затова тествахме дали ефектите от натрупването на Mn могат да бъдат намалени чрез третиране на мишки с Na2 метален хелатор CaEDTA. На 5-месечна възраст лекувахме мишки от див тип и Slc39a14 -/- Na2 CaEDTA в продължение на 4 седмици, използвайки стандартен терапевтичен протокол [44, 45]. Терапията с хелатиране не е оказала ефект върху серумните нива на Mn (фигура 2д) или производителността на ротарод (фигура 2е) при диви мишки; обаче при мишки Slc39a14 -/- лечението с Na2 CaEDTA значително намалява серумните нива на Mn (от 0,1 ng μl -1 до 0,05 ng μl -1; Фигура 2д) и значително подобрява производителността на rotarod (Фигура 2f).

Загубата на експресия на Slc39a14 променя експресията на различни Mn транспортери в няколко тъкани

Нива на експресия на различни Mn транспортери при див тип и мишки Slc39a14 -/-. Измервани са нива на mRNA на Slc39a8, Slc13a5, Slc2a4, Dmt1, Fpn1 и Slc30a10 в черния дроб ( а ), кора ( б ), хипокампус ( ° С ), малкия мозък ( д ), сърце ( д ), бъбреци ( е ), далак ж ) панкреас ( з ), черво ( i ) мишки от див тип (WT) и Slc39a14 -/- (KO)> на възраст 24 седмици. (п = 4 мишки/група). ND означава неоткрит, * P fl/fl; Alb-Cre + мишки), използвайки условна нокаут стратегия (Фигура 4а). Мишият ген Slc39a14 кодира две изоформи, които съдържат екзон 5а или 5b [32]. Затова се фокусирахме върху екзон 4, който въвежда преждевременен стоп кодон и в двете изоформи (Фигура 4а). QPCR анализът потвърждава, че чернодробната експресия на Slc39a14 е практически елиминирана в Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre + мишки в сравнение с контролни мишки (Фигура 4b).

Високият хранителен Mn не води до натрупване на чернодробен Mn в специфични за хепатоцитите мишки с нокаут Slc39a14.

Като се има предвид системното натрупване на Mn в мишки Slc39a14 -/- и че черният дроб е основното място за съхранение на усвояването на Mn, медиирано от Slc39a14, предположихме, че са хранени специфични за хепатоцитите мишки Fec39a14 fl/fl; Мишки Alb-Cre + диета с високо съдържание на Mn може да увеличи нивата на Mn в мозъка. Следователно хранехме новоотгледания Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre + и контролни мишки (Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre -) пречистена диета AIN-93G, съдържаща нормална (10 ppm) или висока (2400 ppm) концентрация на Mn [48]. След 30 дни на диета с високо съдържание на Mn, нито телесното тегло (Фигура 5а), нито ротационните характеристики (Фигура 5b) се различават между телесното тегло Slc39a14 fl/fl, Alb-Cre + и контролните мишки; също така не открихме разлика между мишки, хранени с нормална Mn диета, и мишки, хранени с висока Mn диета (сравнете Фигура 5а и b с Фигури 4в и d)). Въпреки това, диета с високо съдържание на Mn повишава серумните нива на Mn в мишки Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre + и контролни мишки, с много по-силен ефект върху мишки Slc39a14 fl/fl; Alb-Cre + (Фигура 5в).

дискусия

Тук ние характеризирахме ролята на металния йонен транспортер Slc39a14 в системния метаболизъм на Mn, използвайки глобални Slc39a14-нокаути и специфични за хепатоцитите Slc39a14-нокаут мишки. Нашите резултати показват, че чернодробният Slc39a14 има специфична роля в поддържането на системна Mn хомеостаза. По-специално установихме, че Slc39a14 регулира усвояването на Mn предимно в черния дроб, което от своя страна медиира нивата на Mn в други тъкани, включително мозъка, сърцето, бъбреците и кръвообращението. Нашите резултати показват още, че Slc39a14 функционира за регулиране на притока на Mn в черния дроб, тъй като мишките Slc39a14 -/- развиват натрупването на Mn в мозъка и други тъкани, но не и в черния дроб. Освен това установихме, че специфичните за хепатоцитите мишки с нокаут Slc39a14 не показват признаци на натрупване на Mn при нормални условия на хранене с Mn; след хранене с високо съдържание на Mn, тези мишки развиват повишени нива на Mn в мозъка и серума, но не и в черния дроб. Като цяло, тези открития предполагат, че чернодробният Slc39a14 регулира Mn хомеостазата, като посредничи при поглъщането на Mn в черния дроб, като предоставя представа за функцията на SLC39A14 при хората.

Поддържането на Mn хомеостаза е от съществено значение за човешкото здраве, а излишъкът от Mn е свързан с натрупването на Mn в мозъка и невродегенерацията [49, 50]. Мутациите в Mn транспортерите SLC39A14 и SLC30A10 са свързани с повишени нива на Mn в серума и мозъка [4, 30] и развитието на PD-подобни симптоми. Освен това излагането на професионални и други екологични източници с високо съдържание на Mn може да причини подобни неврологични симптоми [50, 51]. Пациентите с хомозиготна мутация в SLC39A14 имат повишени нива на Mn в кръвта и мозъка в ранна възраст и развиват дистония-паркинсонизъм [4]. Въпреки това, за разлика от пациентите с мутация в SLC30A10, тези пациенти нямат повишени нива на чернодробен Mn или развиват чернодробно заболяване. В допълнение, Tuschl et al. изтрива експресията на Slc39a14 при зебра и установява повишени нива на Mn в мозъка, но не и в коремните черва. За разлика от това, нашите експерименти, използващи модели за избиване на мишки, осигуряват причинно-следствена връзка между функцията SLC39A14, внос на чернодробен Mn и свързана с Mn невротоксичност. За съжаление не би било възможно тези експерименти да се извършват върху хора.

Ключово откритие на нашето проучване е, че SLC39A14 играе централна роля в регулирането на абсорбцията на Mn в черния дроб. Установихме, че селективното отстраняване на експресията на Slc39a14 в хепатоцитите не причинява Mn претоварване в мозъка, кръвта или други тъкани. За разлика от тях, глобалните мишки с изключването на slc39a14 нарушават регулацията на метаболизма на Mn и пациентите с мутация SLC39A14 развиват поведенчески и двигателни дефицити, подобни на тези при двигателни разстройства [4]. Нашият анализ на мишки, секретиращи хепкоцити, секретиращи хепатоцити, предполага, че натрупването на Mn в кръвта и мозъка не е резултат само от нарушено поемане на Mn в черния дроб. Въпреки че по-рано се съобщава, че мишките Slc39a14 -/- имат намален прием на цинк и повишена абсорбция на желязо [31], нашите ICP-MS данни показват, че мишките Slc39a14 -/- имат нормални нива на Fe, Zn и Cu в тъканта (с единствено изключение: повишени серумни нива на Fe). Като цяло нашите данни предоставят убедителни доказателства, че глобалното заличаване на експресията на Slc39a14 засяга предимно метаболизма на Mn, но има малък ефект върху метаболизма на Fe, Zn или Cu, което предполага, че Slc39a14 функционира предимно като транспортер на Mn.

Механизмът, на който се основава токсичността на Mn, е слабо разбран. Въпреки че централната нервна система е добре известна основна цел за Mn, как Mn се транспортира през кръвно-мозъчната бариера в момента не е известно. Въз основа на нашите резултати, ние вярваме, че SLC39A14 не посредничи директно поглъщането на Mn в мозъка; по-скоро чернодробният SLC39A14 има системни ефекти върху Mn хомеостазата. При хората диетичният Mn се доставя в черния дроб, където образува конюгат с жлъчката и след това се екскретира в червата [52, 53]. При бозайниците Mn се секретира в опашните части на чревния тракт [26]. Тъй като Slc39a14 се експресира върху базолатералната мембрана на лигавичните клетки в проксималното черво [54], възможно е Slc39a14 да играе роля в секрецията на Mn от проксималното черво. Нашите данни освен това предполагат, че разликите в чувствителността към натрупването на Mn между различните тъкани могат да се отдадат на различното разпределение в тъканите на основните Mn транспортери.

Токсичността на Mn е пряко свързана с поведенчески и двигателни нарушения в модели на хора и животни [51, 55], а Ca2TA Na2 често се използва за хелатиране на високи нива на тежки метали, макар и със смесени резултати. Например, Na2 CaEDTA хелаторна терапия намалява натоварването на Mn и обръща свързаната с Mn невротоксичност при един пациент с мутация SLC39A14, но няма ефект при друг пациент със същата мутация [4]. Установихме, че секретиращите Slc39a14 мишки отделят поведенчески и двигателни дефицити, свързани с високи нива на Mn в мозъка, а лечението с Na2CaEDTA значително намалява серумния Mn и подобрява локомоторната функция при тези мишки.

Схематичен модел, показващ ролята на чернодробния Slc39a14 върху вътреклетъчните и системните нива на Mn. (Отгоре) При нормални диетични условия на Mn с нормални нива на Slc39a14 (вляво), Mn се абсорбира от хепатоцити чрез Mn транспортера Slc39a14 (показан в червено) и може да бъде изнесен чрез Mn износител Slc30a10 (показан в зелено). За разлика от това, загубата на експресия на Slc39a14 води до значително намалени нива на Mn в хепатоцитите (вдясно). (Отдолу) Консумацията на диета с високо съдържание на Mn не успява да преодолее намалените нива на Mn в секретиращите slc39a14 хепатоцити, което води до повишено системно натрупване на Mn.