елементи
Хроничната лимфоцитна левкемия (ХЛЛ) се характеризира с натрупване в кръвта и първичните лимфоидни органи на дългосрочни, зрели, но нефункционални В лимфоцити. Известно е, че взаимодействията на левкемичните клетки с микросредата са критични за оцеляването на CLL клетките in vivo. CLL клетките могат да оцелеят дълго време in vivo, докато клетките се подлагат на апоптоза бързо in vitro. Тази спонтанна апоптоза и лекарствената чувствителност на CLL клетките, наблюдавани in vitro, са силно намалени в присъствието на стромални клетки, 2, 3, 4, 5, които осигуряват стимули за CLL клетките главно чрез директен контакт. По този начин, имитирането на условия in vivo за изследване на механизмите, участващи в резистентността към CLL, изисква създаването на кокултурни системи. МикроРНК (miRNAs) са важни регулатори на генната експресия и допринасят за патологията на CLL. 6, 7, 8 Напоследък е описана голяма промяна в нивата на miRNA в CLL клетки след директно култивиране върху стромални клетки. 9, 10
Изображение в пълен размер
За по-нататъшно потвърждаване на нашите резултати проведохме кокултурни експерименти на CLL клетки с различни видове стромални клетки. CLL клетките се събират след 24 часа чрез внимателно пипетиране, за да се получат всички CLL клетки. Внимателното микроскопско изследване потвърждава цялостната цялост на монослоя от стромални клетки. МикроРНК анализът на получените клетки показа драматично увеличение на нивата на miR-99a и miR-125b (Фигура 2а), потвърждавайки резултатите, описани от Willimott и Wagner 9, използвайки миши фибробластни стромални клетки. За разлика от това, увеличение на нивата на miR-9, отчетено в CLL клетки след култивиране върху миши фибробласти 9, не е установено след култивиране върху BM-MSC или HMEC-1 клетки (данните не са показани). Интересното е, че miR-9 не може да бъде открит в BM-MSC и HMEC-1 клетки, но е по-обилен в NIH/3T3 клетки.
Влияние на замърсяването на стромални клетки върху нивата на miRNA в клетъчните суспензии на CLL. CLL клетките се култивират в шест ямкови плаки при 3 х 106/ml върху 60% сливащи се стромални клетки в продължение на 24 часа. miR-99a и miR-125b бяха открити чрез RT-qPCR, използвайки анализи на TaqMan microRNA. ( а ) МикроРНК нива в CLL клетки след култивиране на BM-MSC или HMEC-1. CLL клетките бяха получени чрез внимателно пипетиране нагоре и надолу. Резултатите бяха нормализирани до U6 РНК. ( б ) Количествено определяне на MicroRNA в CLL клетки, култивирани самостоятелно и смесени със стромални клетъчни супернатанти. Супернатантите на стромални клетки и CLL суспензиите бяха отстранени от ямките без предварително пипетиране, за да се предотврати отделянето на клетки. ( ° С ) МикроРНК нива в CLL клетки и пелети, получени от стромални клетъчни супернатанти. Резултатите се отчитат в Ct стойности, съответстващи на RT-qPCRs на равни обеми РНК. ( д ) Количествено определяне на MicroRNA в CLL клетки, умишлено замърсени със стромални клетки в съотношение 1: 1000 stromal: CLL клетки. Резултатите бяха нормализирани до U6 РНК.
Изображение в пълен размер
За да се открие възможен трансфер на miRNA от стромални клетки към CLL клетки чрез извънклетъчни везикули 13 или чрез междуклетъчна междуклетъчна комуникация (GJIC), 14 CLL клетки и стромални клетки са съвместно култивирани с мембрана (0,4 μm пори, Transwell, Corning, Amsterdam, The. ) или в присъствието на GJIC инхибитор 1-октанол (0,5 μM, Sigma, Diegem, Белгия). Установихме, че мембраната премахва повишаването на нивата на miR-99a и miR-125b в CLL клетки, докато GJIC инхибиторът не показва ефект (данните не са показани). Тези резултати изключват прехвърлянето на тези miRNAs от стромални клетки към CLL клетки чрез извънклетъчни везикули или GJICs.
В обобщение, представените наблюдения подчертават, че при специфични експериментални условия много ограничен брой замърсяващи клетки могат да доведат до резултати от артефакти по отношение на количественото определяне на miRNA. Този доклад подчертава необходимостта от подходящ контрол в сложни системи за сътрудничество. В светлината на това проучване сортирането на клетки от смесени клетъчни популации с чистота до 99,9% не винаги може да попречи на неправилни заключения относно експресията на miRNA. Поради високата чувствителност на настоящите методи, подобни опасения могат да се отнасят и до иРНК и анализи на протеини.
Допълнителна информация
PDF файлове
Допълнителна таблица
Принос на автора
JP и EM проектираха и проведоха изследването, анализираха данните и написаха ръкописа; GB набира пациенти с CLL и редактира ръкописа.