хомининова

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • ZooMS скрининг за остатъци от хоминин
  • Микро CT сканиране DC1227
  • Радиовъглероден анализ DC1227
  • Последователности на митохондриална ДНК (mtDNA) от проба DC1227
  • заключения
  • методи
  • увеличавам
  • CT сканиране
  • Митохондриален ДНК анализ
  • Извличане на ДНК и подготовка на библиотека
  • Митохондриално улавяне и секвениране
  • Обработка на последователности и картографиране
  • Филогенетичен анализ
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Excel файлове
  • Допълнителна информация 1
  • Коментари

елементи

  • археология
  • Масова спектрометрия

абстрактно

ДНК секвенирането революционизира нашето разбиране за архаични хора през средния и горния палеолит. За съжаление, докато много палеолитни обекти съдържат голям брой кости, повечето нямат диагностичните елементи, необходими за традиционната морфологична идентификация. В резултат регенерацията на човешки останки от плейстоцен е много рядка. За да заобиколим този проблем, използвахме метода за отстраняване на колаген върху над 2000 фрагментирани кости от пещерата Денисова пещера в Русия, за да улесним откриването на човешки останки. Резултатът от нашия анализ беше идентифицирането на единична хомининова кост (Денисова 11), подкрепено от задълбочен анализ на пептиди и установено, че съдържа митохондриална ДНК от неандерталски тип. Последвалите датировки с въглерод показват, че костта е на повече от 50 000 години. Тук ние демонстрираме огромен потенциален пръстов отпечатък за идентифициране на остатъци от хоминин в силно фрагментирани археологически сборища, като по този начин подобряваме наличните ресурси за по-широки изследвания на човешкото развитие.

Следователно фомини от Хоминин от пещерата Денис се оказаха много ценни за нашето разбиране на архаичните популации на хоминините. Това се подчертава от изключителното състояние на запазване на древните ДНК молекули в някои от костите, придобити на място. Например, Denisovan fhalanx (Denisova 3) съдържа> 70% ендогенна ДНК, която осигурява геном с високо покритие (30x) 7. Въпреки интензивните разкопки в пещерата на Денис, сред хилядите изкопани кости са намерени само няколко остатъка от хоминин. Идентифицират се или зъби, или малки размери, обикновено фаланги, които са по-малко склонни да развият фрагментация, което води до загуба на диагностични характеристики. Подобна фрагментация, причинена от тафономия на околната среда и месоядна или човешка дейност, води до висок процент на възстановяване на костите от този и много други археологически обекти, които не могат да бъдат идентифицирани по тяхната морфология 3, 8. Само в източната галерия на пещерата Денис при разкопки между 2005 и 2013 г. са получени приблизително 135 600 кости; 128 591 обаче не могат да бъдат идентифицирани 8 .

Тук прилагаме метод за идентификация на видовете чрез масово сканиране на колагенов пептид, известен като Zooarchaeology by Mass Spectrometry (ZooMS) към 2315 архивирани неидентифицируеми костни фрагменти от пещерата Денис. Тези недиагностични кости са избрани от материал, извлечен от източната галерия на пещерата през 2014 г. Остатъците варират по размер, обикновено варират от 3 до 5 см, с кости, които са били достатъчно големи, за да бъдат полезни за по-нататъшен анализ (т.е. въглерод и ДНК анализ) за предпочитане избран. В близкото минало анализът на ZooMS е успял да направи разлика между различни групи бозайници, включително опитомени таксони 9, 10, диви сухоземни таксони 11, 12 и морска фауна 13, както и някои небозайникови таксони 13, 14. това ZooMS използва за анализ на доминиращия протеин в костите, пептиден пръстов отпечатък, колаген тип 1 (COL1), който е известен със своята дълготрайност, особено в по-студен климат. Този метод дава колагенови пръстови отпечатъци в проби, вариращи до

резултатът

ZooMS скрининг за остатъци от хоминин

Публикуваните досега маркери за хора са обозначени с A-G. Всички номерирани пикове представляват потвърдени съответстващи на последователността пептиди, наблюдавани в човешки колаген (с изключение на Е, което е известно само за сходство с хомоложни маркери при други видове 9).

Изображение в пълен размер

Пробата, която беше идентифицирана като хоминин DC1227, беше изкопана от квадрат A-2, слой 12 на източната галерия. Преди вземане на проби костта тежи 1,68 g, с максимална дължина 24,7 mm и ширина 8,39 mm. Приблизително 36 mg бяха събрани за ZooMS анализ (фиг. 2). Костта изглежда доста незначителна, без никакви морфологични характеристики или доказателства за промяна на предназначението, така че е лесно пренебрегната при остеологичния анализ.

Изображение в пълен размер

Микро CT сканиране DC1227

Микрокомпютърната томография (микро-КТ) беше извършена преди по-нататъшно разрушително вземане на проби за анализ на въглерод и митохондриална ДНК. Поради рядкостта на тази находка, микро-КТ се счита за подходяща за идентифициране на зони, които са били засегнати от видимо разграждане и следователно трябва да се избягва при бъдещ анализ. Резултатите показаха, че пробата е много плътна и без поредица от диагенетични микропукнатини, преминали през нейната дължина, без признаци на костна деградация. Три от тези микрометрични пукнатини преминават в непосредствена близост една до друга през костта, но не образуват пукнатини и не изглежда да нарушават костната структура. Сканирането също така подчертава степента на офорт и вдлъбнатини върху костната повърхност, което може да се дължи на преминаване през храносмилателната система на месоядни животни (Фигура 3). Редица месоядни животни са определени на място; Поради появата на хиени в Денисовата пещера изглежда вероятно костта да е ецвана от киселина през стомашните киселини на хиена 8, .

Изображение в пълен размер

Радиовъглероден анализ DC1227

Радиовъглеродното датиране е извършено в Оксфордското радиоуглеродно ускорително звено (ORAU) съгласно стандартни процедури и протоколи 23, с приблизителна възраст> 49 900 години BP (OxA-32241), което показва, че костта е по-стара от максимално измеримата граница за радиовъглеродно датиране. . костен колаген. Резултатът е напълно в съответствие с предполагаемата геоархеологическа възраст по отношение на съществуващата стратиграфска последователност.

Изотопните измервания на въглерод и азот дадоха стойност от 813C -17,3 ‰ и стойност A515N от 16,4 ‰. Хоминините в този регион обикновено връщат стойностите на азотните изотопи между 13 - 15 ‰, посочени например между неандерталци в пещерата Окладников 24. Повишените нива на DC1227 могат да показват различни диетични аномалии, включително богата на протеини диета, получена от организми с по-високи трофични нива, като сладководни риби 25, 26. За да се поставят увеличените изотопни стойности в правилния контекст, са необходими допълнителни изследвания, които ще бъдат обсъдени в бъдеще. Подобни изследвания на изотопния състав на хоминин и свързаната с него фауна от Денисова имат потенциала да разкрият важна информация за диетата на палеолитните хоминини, живеещи на Алтай, и такива изследвания в момента се провеждат в Оксфордския университет.

Последователности на митохондриална ДНК (mtDNA) от проба DC1227

Извличаме ДНК от 30,9 mg костен прах от DC1227 27. Аликвотна част от екстракта се прехвърля в едноверижна ДНК библиотека 28, която се обогатява за хомининови митохондриални ДНК фрагменти с помощта на човешки митохондриални сонди 29. Изолираните ДНК фрагменти бяха секвенирани и картографирани в ревизираната референтна последователност на човешки митохондрии в Кеймбридж (rCRS). Общо идентифицирахме 282 502 уникални mtDNA фрагменти, по-дълги от 35 базови двойки (допълнителна таблица S1).

За да се оцени дали някои от mtDNA фрагментите са от древен произход, използвахме факта, че цитозиновите (С) основи в краищата на ДНК молекулите са склонни да претърпят дезаминиране с течение на времето и следователно се броят като тимини (Т) от ДНК полимераза. По този начин, древните фрагменти на ДНК, подравнени с референтна последователност, са склонни да носят високи честоти на очевидни заместители от С до Т в техните 5'- и 3'-края 31, 32, 33. От фрагментите, започващи или завършващи в позиции, където rCRS основата е C, 32, 2% и 31, 3% носят Ts в техните 5 'и 3' краища (Допълнителна фигура S13), което предполага, че в DC1227 присъстват древни ДНК молекули на хоминин.

За да определим дали ендогенната DC1227 mtDNA е най-директна с митохондриални геноми на съвременни хора, неандерталци или денисовци, ограничихме анализа до последователности, носещи заместване от C до T в сравнение с rCRS в един от краищата им 34, за да намалим въздействието на предполагаемите данни. замърсяване с актуална човешка ДНК (допълнителна информация). Използвайки 36 665 такива последователности (допълнителна таблица S1), митохондриалният геном на проба DC1227 е реконструиран със средно покритие 130 пъти, като 63 позиции остават покрити от две или по-малко последователности и четири, където по-малко от две трети от последователностите съдържат еднакви база. По този начин 67 позиции не могат да бъдат назовани със сигурност.

Сравнявайки DC1227 mtDNA с пълната неандерталска mtDNA, определена досега, тя дава пет основни разлики спрямо неандерталската mtDNA Okladnikov 2 33, открита на около 60 км от пещерата Денис, 12 до 17 разлики от неандерталците от Западна и Южна Европа и 31 Mezmaiskaya 1 от Кавказ 35 и неандерталецът в пещерата Денис 5. За сравнение, mtDNA от DC1227 се различава между 174 и 354 основи от mtDNA на други хомининови групи (Допълнителна таблица S2). По този начин, при филогенетичния анализ (фиг. 4), митохондриалният геном DC1227 попада във вариация от десет неандерталци, с изключение на 311 съвременни хора, десет древни съвременни хора, двама денисани и средноплейстоценския хоминин от Испания. Заключваме, че индивидуалният DC1227 носи митохондриален геном от неандерталски тип и сега се нарича Денисова 11.

MtDNA на шимпанзе (не е показано) беше използвана като изходна група. Поддръжката за всеки клон се основава на 500 репликации на bootstrap. Географският произход на древните образци е даден в таблица S2.

Изображение в пълен размер

заключения

методи

увеличавам

От всяка кост в групата се вземат 20 до 50 mg кост и се деминерализира в 0,6 М солна киселина (HCI) в продължение на 18 часа. Полученият остатък се отстранява до ултрафилтър с 30 kDa прекъсване на молекулното тегло (MWCO) и се центрофугира при 3700 об/мин за 1 час. След това филтратът се промива два пъти с 500 μl 50 mM амониев бикарбонат (AmBic) и допълнително се центрофугира при 3700 rpm. В продължение на половин час след всяко лечение. Крайният остатък се ресуспендира с допълнителен AmBic (200 μL), половината от които се отстранява, за да се образува резервна проба преди разграждането. След това останалите 100 μl се третират с 0,2 μg трипсин (стъпка на секвениране; Promega UK) и се инкубират при 37 ° С в продължение на 18 часа. След това полученият разтвор се смесва с матричен разтвор от 1 μl разтвор на а-циано-4-хидроксикинамиена киселина (10 mg/ml в 50% ацетонитрил (ACN)/0,1% трифлуороцетна киселина (TFA)) и се оставя да се кокристализира. и се анализира с помощта на масспектрометър Bruker Ultraflex II (Bruker Daltonics, Bremen) MALDI Tof/Tof. Получените мас спектри бяха скринирани за човешки маркери 9, 12 в софтуера FlexAnalysis.

CT сканиране

CT сканирането беше извършено с помощта на микро скенер Nikon XT H 225 с трансферна цел. Правени са опити да се поддържа дозата възможно най-ниска, за да се избегнат всякакви повреди на пробата, така че сканирането да се извършва при 70kv и 80 μA. Реализирани са общо 1448 проекта в две изображения на проекция, като експонацията е зададена на 100 ms и увеличението е × 7, 2. Данните са реконструирани с помощта на софтуера CT Pro 3D и обработени с помощта на софтуера VG Studio Max 2.1.

Митохондриален ДНК анализ

Извличане на ДНК и подготовка на библиотека

30,9 mg костен прах бяха отстранени от DC1227 с помощта на зъбна бормашина. ДНК беше извлечена с помощта на протокол, базиран на силициев диоксид, за да се получат къси ДНК молекули 27, 36. 10 μl ДНК екстракт (E3128) се превръщат в едноверижна ДНК библиотека (A9301), както е описано в 28, 36. Броят на ДНК молекулите в библиотеката беше оценен чрез PCR с цифрови капчици (BioRad QX 200), като се използва 1 μl като вход за анализ EvaGreen (BioRad) с праймери IS7 и IS837. Библиотеката беше кодирана с два уникални индекса 36, 38 и усилена с AccuPrime Pfx ДНК полимераза (Life Technologies) 39. Продуктите за амплификация се пречистват с помощта на пречистващия комплект за PCR MinElute (Qiagen); и се определя количествено на фотоспектометър NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies).

Митохондриално улавяне и секвениране

Усилената библиотека (A9317) беше обогатена с хибридизационен протокол 29 за улавяне на зърна, използвайки 52-измерни сонди 40, проектирани в плочки с единична основа на rCRS (справка NC_012920 на Националния център за биотехнологична информация [NCBI]) в два кръга на улавяне като се използва 1 μg съответно 0,5 μg входна ДНК. Уловената библиотека (L5502) беше секвенирана на платформа MiSeq (Illumina), използвайки сдвоени краища (2 x 76 цикъла) с конфигурация с двоен индекс от 38. По време на процедурата като отрицателни контроли бяха извършени един празен цикъл на екстракция на ДНК и един цикъл на подготовка на празна библиотека.

Обработка на последователности и картографиране

Основният разговор беше направен с помощта на дрофа (Illumina). Последователностите на адаптера бяха отсечени и четенето напред и назад беше обединено в отделни последователности 41. Последователностите, на които липсваха перфектни съвпадения с очакваните баркодове, бяха изхвърлени. Картирането към референтния геном се извършва с помощта на BWA 42 с параметри "-n 0, 01-02-1 16500" 7. PCR дубликатите бяха премахнати чрез сливане на последователности с еднакви начални и крайни координати за подравняване, използвайки bam-rmdup (//github.com/udo-stenzel/biohazard). Поредици, по-дълги от 35 бази с качество на картографиране по-високо от 30 бяха оставени за по-нататъшен анализ.

Филогенетичен анализ

За реконструиране на DC1227 mtDNA бяха използвани последователности, носещи терминал С до Т заместване. Терминалът Ts в първата или последната позиция на всяка последователност беше преобразуван в Ns, за да се намали ефектът от грешки в последователността, произтичащи от консенсусно увреждане на повикването. Основата на консенсуса беше определена, ако позицията беше покрита от поне три последователности и ако поне 67% от последователностите, т.е. повече от две трети от припокриващите се последователности, съдържаха идентична основа 34 .

MtDNA беше сравнена с mtDNA 311 сегашни хора 43, 10 стари съвременни хора 31, 44, 45, 46, 47 десет неандерталци 5, 33, 35, 48, 49, два денизована 3, 4 и среден плейстоцен хоминин 34 и шимпанзе (Pan troglodytes, NC_001643) 50 от MAFFT 51. Броят на основните разлики между последователностите и дървото, свързващо съседката с 500 репликации на bootstrap 52 въз основа на тези разлики, е генериран от MEGA6 53 .

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Brown, S. et al. Идентифициране на нова хомининова кост от пещерата Денис в Сибир чрез анализ на пръстови отпечатъци на колаген и митохондриална ДНК. Sci. Представител. 6, 23559; doi: 10, 1038/srep23559 (2016).

Код за достъп: Митохондриалната геномна последователност на проба DC1227 (Денисова 11) се съхранява в GenBank (номер за присъединяване KU131206).

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителна информация

Excel файлове

Допълнителна информация 1

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или несъвместимо с нашите условия или насоки, означете го като неподходящо.